福尔马林固定石蜡包埋组织DNA的提取及影响因素,2012.12 娄全博,现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类的疾病研究，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展等方面均具有重要意义 医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现Goelz(1985)成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值石蜡包埋组织DNA提取的流程图,组织包埋制作过程中的影响因素,1.1福尔马林固定 福尔马林固定液的主要成分：甲醛是最小的含氧有机物，具有较高的反应活性，可以和带有-OH（羟基）、-SH（巯基）、-NH2（氨基）的分子发生亲核加成反应，最终作为亚甲基(-CH2-)的提供者，与上述基团中的两个基团反应，使自由的分子链被交联起来，从而发挥对组织固定的作用，同时也对DNA分子产生不利的影响。
最早表现为DNA分子呈可逆性亚氨基和氨基的羟甲基化，随固定时间延长，生物大分子之间缓慢形成广泛的亚甲基交联桥，导致DNA链的脆性增加，在受到剪切力作用时，更容易发生随机断裂[1]甲醛介导的DNA损伤，在固定3h后已发生固定时间越长，甲醛所致DNA损伤越严重，越不易从中获得大片段DNA相关文献记载固定时间分别为3、7、16、32d且保存15年的包埋组织进行研究的结果显示，固定16d可成功获取250bp左右的DNA片段，固定32d则仅能获取100bp左右DNA片段[2] 甲醛除本身可造成DNA分子损伤外，其与氧化性物质接触后形成的甲酸，可改变环境pH，从而影响DNA分子稳定性，使核酸中嘌呤基的β糖苷键容易发生水解而导致DNA链断裂[3]实验证明，中性缓冲型福尔马林固定剂能有效中和甲醛氧化生成的甲酸，使环境pH得以稳定，在所提取DNA的质和量上都明显优于其他固定剂1.2 浸蜡与包埋 用于组织包埋的固体石蜡为多种烃烷混合物，溶程为50℃～65℃，其化学性质稳定，在通常条件下不与酸性（除硝酸外）和碱性溶液发生作用迄今尚无石蜡能直接导致包埋组织中DNA降解的报道但有文献记载，在石蜡包埋过程中DNA更容易发生降解。
其可能的机制是组织浸蜡与包埋时需要加热到62℃左右，此时DNA部分解链，组织内残留的痕量甲醛可对解链后的DNA单链进行甲基化修饰，修饰后的DNA单链在冷却后不易复性而导致的降解[4] 另外，石蜡可阻碍消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶K与组织内蛋白的接触，影响组织消化和DNA释放在DNA提取过程中，如未能有效去除石蜡，形成的DNA-石蜡混合液，不利于PCR 扩增[5]1.3 切片规格 为保证包埋组织中提取的DNA量能够满足后续检验的需求，可通过增加切片厚度或增加切片的张数来实现但切片过厚不利于组织脱蜡和蛋白酶消化，而切片过薄易造成DNA的机械损伤，同时切片总面积的增加，其表面黏附的PCR抑制因子将可能增多[6]文献中对比观察切片厚度为2.5μm、5.0μm 和10.0μm三种情况下进行二甲苯脱蜡后，有机溶剂法提取DNA的质量差异三者比较，10.0μm切片DNA质量最好，2.5μm切片提取的DNA在PCR扩增后电泳，虽可见目的基因条带，但条带较淡，目的基因测序图混乱，难以读出碱基序列，效果远不如其他两种情况[7]DNA提取的预处理—脱蜡,为消除石蜡对DNA提取和PCR扩增的不良影响，必须在保证不增加外源性PCR抑制因子的和尽量减少DNA额外损伤的前提下对组织进行彻底地脱蜡，这是与其他生物性检材提取DNA过程的最大不同点。
2.1 有机溶剂脱蜡法 二甲苯是被常用于包埋组织脱蜡的高效有机溶剂首先将石蜡包埋的组织浸泡在二甲苯溶液中于室温下脱蜡，一般进行两次，分别为2h和12h然后用梯度乙醇(100%至70%)复水，使组织结构疏松,利于消化液渗入，同时去除组织中痕量的二甲苯和甲醛待乙醇自然挥发后将组织浸泡于消化缓冲液根据需要，可适当提高二甲苯脱蜡的温度(48℃或65℃)、增加脱蜡的次数、延长脱蜡或复水时间等该法脱蜡比较彻底，利于组织消化，但是过多的操作步骤增加了DNA受污染的可能，亦容易人为地造成DNA机械性损伤，并且需要接触有毒物质二甲苯2.2加热脱蜡法 通过加热使石蜡溶解，继而从组织中分离出来的方法，比较省时省力，同时也避免了接触有毒化学试剂但DNA受热后不稳定，组织内释放出的一些金属离子以及核酸酶等易对其造成损伤，加热温度越高时间越长，DNA受损则越严重另外, 组织受热不均, 脱蜡有不彻底的可能2.2.1 水浴加热脱蜡法 将组织样本浸泡于生理盐水中，在接近石蜡熔点的温度（65℃）下水浴，重复1次～2次，可达到去除石蜡的目的有研究表明，水浴加热时间与大片段DNA检出率成反比, 建议采用65℃水浴10 min效果较好[8]。
也有研究提出用TES液（10 mmol Tris-HCl、1 mmol EDTA、0.5% SDS）代替生理盐水进行水浴加热脱蜡, 能有效提高DNA 的产量和质量[9] 2.2.2 微波加热脱蜡法 将装有组织切片的离心管中加入消化缓冲液(50 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，0.5% Tween20 pH 8.5)，密封后，置于微波炉中加热2min（时间长短视石蜡而定），利用电磁波的穿透力，对组织进行深层加热，可在短时间内对组织进行比较彻底地脱蜡[10]该法与传统的二甲苯脱蜡法相比，具有高产量提取，高效率扩增的优势，而且具有操作简单、实验消耗少、污染危险性小等优点，是一种值得提倡的方法包埋组织中DNA提取的注意事项,3.1 蛋白酶K的消化作用 3.1.1酶浓度 适当地增加蛋白酶K浓度和延长消化时间将有利于组织消化和DNA的释放通过比较不同浓度蛋白酶K（0.5 mg/mL，1.0 mg/mL和4.0 mg/mL）对包埋组织的消化效果后发现，消化液中蛋白酶K浓度越高，消化时间越长获取的DNA量越多然而，随着蛋白酶K浓度的升高，提取的DNA数量虽然增多，但质量反而有所下降，对较大DNA 片段（大于200bp）进行PCR扩增的成功率也下降，其原因不明[11]。
3.1.2 消化温度 蛋白酶K的最佳工作温度是56℃, 温度过低不利于发挥蛋白酶K活性，过高则不利于保护DNA的完整性，故新鲜组织与冰冻组织通常选择37℃下消化过夜研究表明37℃和56℃两个温度下蛋白酶K消化包埋组织的效果进行了比较，发现56℃消化不仅可获得较多量的DNA，而且可产生高质量的DNA[12] 3.1.3 消化缓冲液的离子强度 在高离子强度的环境下，生物大分子链趋于高度螺旋收缩状态，因此，甲醛介导的DNA与核蛋白之间的交联结构，在中、高离子强度下将得以稳定存在反之，采用低离子强度的消化缓冲液将利于舒展其分子结构，从而促进蛋白酶的消化作用3.2 选择合适的DNA提取方法 DNA分子因受甲醛作用脆性增加，受机械剪切力作用后容易发生断裂因此，提取DNA过程中，应当避免剧烈振荡和过高的温度，尽量减少提取过程中的操作步骤，以减少对DNA分子的额外损伤包埋组织中DNA提取方法主要分为两类一类是基于蛋白酶K消化的DNA提取方法, 其中有机溶剂法提取的DNA在纯度上有着明显的优越性，但其实验过程中需多次移管、震摇和离心操作，既容易加重DNA的机械损伤，又容易导致外来PCR抑制物的污染氯化钠盐析法是通过在包埋组织经蛋白酶K消化后的溶液中加入高浓度盐溶液（等体积3 mol/L的NaCl溶液），破坏蛋白质在水中的稳定性因素而达到沉淀的目的，其实验过程简便快捷、造价低廉、无须接触有毒化学试剂，而DNA产量和PCR分型成功率与前者效果相当。
另一类是基于水煮加热的一步提取法，在水煮液中加入终浓度10%的Chelex-100或终浓度1%的Tritonx-100 Chelex-100是一种由聚乙烯乙二烯苯组成的螯合基团，能螯合包埋组织在高温裂解后释放的内源性二价金属离子，如Mg2+、Ca2+等, 从而阻止其在高温下与断裂DNA的作用; Tritonx-100则是一种强的非离子表面活性剂，能促进蛋白成份变性溶解3.3 去除PCR抑制因子 包埋组织提取DNA中存在着一些不能通过蛋白酶K消化和有机萃取法去除的PCR反应抑制因子，随包埋组织取量的增加, 其抑制效果越明显[13]例如，包埋组织中DNA严重降解后出现的大量寡核苷酸碎片，在PCR扩增时，可竞争性结合反应体系中的Mg2+ ，降低Mg2+的有效浓度，从而降低DNA聚合酶酶的活性，同时还可干扰引物与模板的结合而降低PCR扩增效率采用凝胶层析技术可以有效地去除寡核苷酸片段的影响,总而言之，包埋组织中DNA的提取和PCR的扩增比较困难，影响因素颇多，研究还不是十分透彻上述各种方法虽各具针对性，但是基于效率、卫生、经济，尤其实验稳定性的考虑，都不很理想对于包埋组织中客观存在的PCR扩增抑制因子的研究并不明朗，300bp以上DNA片段的提取和PCR 扩增的成功率非常低, 500bp以上片段的成功率则是偶有报道[12]，这很难满足医学科研需要。
因此，建立一种实用、有效的从包埋组织中提取DNA的方法，合理调整制定PCR扩增对策等问题,还将有待进一步深入的研究[参考文献],[1] Mies C, Houldsworth J, Chaganti RS. Extraction of DNA from paraffin blocks for Southern blot analysis [J]. Am J Surg Pathol, 1991,15(2):169-174. [2] Legrand B, Mazancourt P, Durigon M, et al. DNAgenotyping of unbuffered formalin fixed paraffin em-bedded tissues[J]. Forensic Sci Int,2002,125:205-211. [3] V Zsikla, Baumann M, Cathomas G. Effect of bufferedformalin on amplification of DNA from paraffin waxembedded small biopsies using real-time PCR [J]. ClinPathol,2004,57:654-656. [4] Moerkerk PT, Kessels HJ, Ten Kate J, et al. Southernand dot blot analysis of DNA from formalin-embedded tissue samples from colonic carcinomas [J]. Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol,1990,58(5):351-355. [5] Lonn U, Lonn S, Nilsson B, et al. Demonstration ofgeneamplifica-tion by PCR in archival paraffinembedded breast cancer tissue [J]. Breast Cancer ResTreat,1994,30(2):147-152.,[6] Legrand B, Mazancourt P, Durigon M, et al. DNA genotyping of unbuffered formalin fixed paraffin em-bedded tissues[J]. Forensic Sci Int,2002,125:205-211. [7] 盖宝东, 房学东, 金仲田. 提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究[J].吉林大学学报(医学版),2003,29(1):115-118. [8] 周毅, 严红, 李万水, 等. 石蜡包埋人体组织DNA分型的研究[J]. 刑事技术,2003,4:17-18. [9] 刘德莉. 一种石蜡包埋组织DNA提取方法[J]. 上海医学检验杂志,2000,15(2):128. [10] Sato Y, Sugie R, Tsuchiya B, et al. Comparison of the DNA extraction methods for polymerase chain reaction amplification from formalin fixed and paraffin embedded tissues [J]. Diagn Mol Pathol,2001,10(4):265-271. [11] Kosel S, Graeber MB. Use of neuropathological tissue for molecular genetic studies: parameters affecting DNA extraction and polymerase chain reaction [J]. Acta Europathol,1994,88(1):19-25.,。