单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,人类染色体标本制备,及核型分析,实验三,1、掌握人类外周血细胞常规核型的标本制备,方法；,2、掌握胰酶法G显带的技术；,3、掌握G显带核型分析的基本过程和技术；,4、熟悉快速线条图的绘制；,5、了解染色体自动分析系统的原理和使用方法一、目的与要求,二、基本原理,（一）染色体标本制备,外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G,0,期或G,1,期，一般情况下是不分裂的当在培养基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin,PHA）时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂经过短期培养后，用秋水仙素处理、低渗、固定、滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的细胞，制片后可以清楚地对染色体进行观察染色体标本制作技术有下述四大发现：,一、美籍华人徐道觉(1952)从助手工作中的失误发现采用蒸馏水低渗处理分裂细胞可使染色体展开；,二、Tjio(1956)发现秋水仙素可使分裂的细胞停止在中期；,三、LiJG发现PHA(phytohemagglutin)(植物血球凝集素)可使淋巴细胞转化为淋巴母细胞，呈分裂状态；,四、标本的空气干燥法使细胞和染色体展平。
这种培养方法是,Moorhead,于,1960,年建立的在人类遗传分析中普遍采用外周血培养的方法获取分裂的细胞，进而开展临床和基础遗传学的研究这对于遗传疾病的检出以及遗传咨询等工作发挥了重要作用二）染色体显带,人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为,显带技术,（banding technique）研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的G带每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变关于G显带的机理目前有多种说法，较常见的有,1、Lee等（1973）认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带2、有人认为，染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构比如用相差显微镜观察未染色的染色体时，就能直接观察到带的存在用特殊方法处理后，再用染料染色，则带更加清楚，随显带方法不同，显出来的带特点也不一样，说明带的出现又与染料特异结合有关。
一般认为，易着色的阳性带为含有,AT,多的染色体节段，相反，含,GC,多的染色体段则不易着色总的来说，G显带的机理还未搞清三、内容与操作,一、染色体G显带标本的制备,1.采血：采血过程中严格执行无菌操作2接种：超净工作台内 0.30.5ml,轻轻水平摇动混匀培养：5%CO2，375恒温箱培养64-65小时；卡介苗注射器(5号针头)向培养瓶中加入20g/ml秋水仙素（0.01%）一滴，轻轻摇匀，放回温箱继续培养至68小时4、离心：10分钟（1500转分），弃上清液，留下沉淀物5、低渗：68m1预温37的0.075M KCl溶液，沉淀细胞,重重,冲散，37水浴箱30-35分钟6、预固定：1ml新配制的固定剂，,轻轻,冲打，37水浴箱中静置5分钟7、离心：1500转分离心10分钟，弃上清液6第一次固定：固定液68m1，沉淀物,轻轻,冲打均匀，37水浴箱中静置固定10分钟7、第一次离心10分钟(1500转分)，弃上清液8、重复第6、7步9、制片：留固定液0.2ml0.4ml，,轻轻,冲打制成细胞悬液冰冻载波片，滴管口距离载玻片1015cm，每片23滴10、烤片：75烤箱烤3小时自然冷却11、胰酶预温：立式染色缸中磷酸缓冲液100ml（115M NaH2PO4 80.8 ml，KH2PO4 19.2ml)，2.5的胰蛋白酶原液1ml配成0.025的工作液。
37的恒温水浴箱内预温12、显带：不断轻轻摆动，使胰酶作用均匀，处理时间2590秒钟左右（较陈旧标本时间适当延长，随着处理标本数量增加，胰酶逐渐消耗，胰酶作用时间逐渐延长，精确的时间自行摸索）取出标本片，立即用37预温的生理盐水轻轻漂洗两次，去除片子上的胰酶溶液13、染色：37预温的Giemsa工作液染色12分钟，自来水冲洗，气干14、镜检：低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相转换油镜观察，若染色体未出现带纹，则为显带不足；若染色体边缘发毛为显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本注意事项,玻片完全干后，才可置油镜下进行观察每次显带均应做予实验处理，以决定正确的显带时间，不可盲目处理所有玻片显带效果的判断，应多观察几个长度适中的分裂相,不能仅凭1、2个分裂相的显带效果决定下一步显带时间二、G显带标本的核型分析,一秃二蛇三蝶飞，四象鞭炮五黑腰六号短臂小白脸，七上八下九苗条十号长臂三条带，十一低来十二高，,十三十四十五号，三个一样一二一十六长臂近点深，十七远端带脚镣十八人小肚皮大，十九中间一点腰二十头重脚底轻，二十一象葫芦瓢二十二一点Y黑腰，X pq 一肩挑1号染色体中央着丝粒和次缢痕染色深。
短臂：,近侧段和中段各有一条深带，其中段深带稍宽，在处理较好的标本上，远侧段可显出2-3条淡染的深带此臂分为3个区，近侧的深带为2区1号带，中段深带为3区1号带长臂：,次溢痕紧贴着丝粒，染色浓其远侧为一宽的浅带，中段和远侧段各有两条深带，以中段第2深带染色较浓，中段两条深带稍靠近此臂分为4个区，次溢痕远侧的浅带为2区1号带，中段第2深带为3区1号带，远侧段第3深带为4区1号带一秃,2号染色体,短臂：,可见4条深带，中段的两条深带稍靠近此臂分为2个区，中段第2、3深带之间的浅带为2区1号带长臂：,可见6-7条深带，此臂分为3个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1号带，第4和第5深带之间的浅带为3区1号带二蛇,3号染色体着丝粒染色浓在短臂和长臂的中短各有一条,明显而宽阔的浅带,短臂：,一般在近侧段可见两条深带，远侧段可见3条深带，其中远侧近端部的一条较窄，且着色较淡，这是区别3号染色体短臂的显著特征此臂分为2个区，中段浅带为2区1号带长臂：,一般在近侧段和远侧段各有一条较宽的深带在处理较好的标本上，近侧段的深带可分为3条深带，此臂分为2个区，中段浅带为2区1号带三蝶飞,4号染色体,短臂：,可见1-2条深带，短臂只有1个区。
长臂：,可见,均匀分布的4条深带,，在处理较好的标本上，在2、3深带间还可显出一条较窄的深带此臂分为3个区，近侧段第1、2深带间的浅带为2区1号带；远侧段第3、4深带间的浅带为3区1号带四象鞭炮,5号染色体,短臂：,可见1-2条深带，其远侧的深带宽而且色浓此臂只有1个区长臂：,近侧段有一条深带，染色较淡；,中段可见3条深带,，染色较浓；远侧段可见1-2条深带，近末段的一条着色较浓此臂分为3个区，中段第2深带为2区1号带；中段第3深带与远侧段第1深带之间宽阔的浅带为3区1号带五黑腰,6号染色体着丝粒染色浓短臂：,中段有一条,明显而宽阔的浅带,，近侧段和远侧段各有一条深带，近侧段的深带紧贴着丝粒在处理较好的标本上，远侧段的深带可分为2条深带此臂分为2个区，中段的明显而宽阔的浅带为2区1号带长臂：,可见5条深带，近侧的一条紧贴着丝粒远侧段末段的一条深带窄而且着色较淡此臂分为2个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1号带六号短臂小白脸,7号染色体着丝粒染色浓短臂：,有3条深带，中间的一条深带窄而且着色极淡，有时不明显，远侧近末段的深带着色浓而稍宽，宛如“,瓶盖,”，这常常是辨别7号染色体的明显特征。
此臂分为2个区，远侧深带为2区1号带长臂：,有3条明显的深带，远侧近末段的一条深带着色较淡，第2和第3深带稍接近此臂分为3个区，近侧第1深带为2区1号带；中段的第2深带为3区1号带七上,8号染色体,短臂：,有2条深带，其间有一条较明显的浅带，这是与10号染色体相区别的主要特征此臂分为2个区，中段浅带为2区1号带长臂：,近侧段可见2-3条分界不明显的深带，,远侧段,有一明显而恒定的深带此臂分为2个区，中段深带为2区1号带八下,9号染色体着丝粒染色浓短臂：,远侧段可见两条深带，在有的标本上融合成一条深带此臂分为2个区，近侧的第1深带为2区1号带长臂：,可见两条明显的深带，次溢痕一般不着色，在有些标本上呈现特有的狭长“,颈部区,”此臂分为3个区，近中段的一深带为2区1号带，远侧段的一深带为3区1号带九苗条,10号染色体着丝粒染色浓短臂：,近中段有一条深带此臂只有1个区长臂：,可见明显的3条深带，近侧的一条着色最浓该长臂上的这3条明显的深带是与8号染色体相区别的一个,主要特征,此臂分为2个区，近侧段的第1深带为2区1号带十号长臂三条带,11号染色体着丝粒染色浓短臂：,近中段可见一条宽的深带，在处理较好的标本上，这条深带可分为两条较窄的深带。
此臂只有1个区长臂：,近侧有一条深带，紧贴着丝粒，近中段可见一条明显的较宽的深带，在这条深带与近侧深带之间有一条,宽阔的浅带,在处理较好的标本上，近中段的这条较宽的深带可分成两条较窄的深带，两深带之间有一条很窄的浅带，后者虽常不明显，但却是分区上的一个界标在有些标本上近末端处尚可见一条窄的浅色的深带此臂分为2个区，界标即2区1号带为上述近中段两深带之间的那条很窄的浅带十一低来,12号染色体着丝粒染色浓短臂：,中段可见一条深带，此臂只有一个区长臂：,近侧有一条深带紧贴着丝粒中段有一条宽的深带，这条深带与近侧深带之间有一条明显的浅带，但与11号染色体比较，这条,浅带较窄,，这是,鉴别11号与12号,染色体的一个主要的特征在处理较好的标本上，中段这条较宽的深带可显出3条较窄的深带，且正中一条着色较浓在有些标本上，远侧段还可见1-2条窄的染色较淡的深带此臂分为2个区，中段正中着色较浓的深带为2区1号带十二高,13号染色体着丝粒和短臂染色浓长臂：,可见4条深带，第1和第4深带较窄、染色较淡；,第2和第3深带较宽、染色较浓,此臂分为3个区，第2深带为2区1号带，第3深带为3区1号带十三十四十五号，,三个一样一二一,14号染色体着丝粒和短臂染色深。
长臂：,近中段和远侧段各有一条较明显的深带,在处理较好的标本上其近侧可显出一条深带，其中段可显出一条着色较淡的深带此臂分为3个区，近侧第2条深带为2区1号带，远侧第4深带为3区1号带15号染色体着丝粒和短臂染色浓长臂：,中段有一条明显的深带,，染色较浓在有的标本上其近侧段可见1-2条淡染的深带此臂分为2个区，中段深带为2区1号带16号染色体中央着丝粒和次缢痕染色浓短臂：,中段有一条着色较淡的深带，在有的标本上可见两条深带此臂只有一个区长臂：,除次缢痕外有两条深带，远侧段的一条有时不明显此臂分为2个区，中段深带为2区1号带十六长臂近点深,17号染色体着丝粒染色浓短臂：,中段有一条深带此臂只有一个区长臂：,远侧段可见一条深带，这条深带与着丝粒相连的深带之间为一明显而宽的浅带此臂分为2个区，上述浅带为2区1号带十七远端带脚镣,18号染色体,短臂：,一般为浅带此臂只有一个区长臂：,近侧和远侧各有一条明显的深带此臂分为2个区，两条带之间的浅带为2区1号带十八人小肚皮大,19号染色体着丝粒及其周围为深带，其余均为浅带在有的标本上其长臂近中部可显出一条着色极淡的深带短臂和长臂均只有一个区十九中间一点腰,20号染色体着丝粒染色浓。
短臂：,中部有一条明显而浓染的深带此臂只有一个区长臂：,在远侧段可见1-2条染色。