棉铃虫 Bt 抗性的检测技术摘要：棉铃虫Helicoverpa armigera (Hubner)是棉花上的一种重要害虫，上世 纪 90 年代初曾在我国大面积爆发，给农业生产造成巨大的经济损失从 1997 年转Bt基因棉花在我国商业化种植以来，棉铃虫的发生得到了有效控制但是 随着Bt棉的大面积种植，棉铃虫处于长期的选择压力下，其对Bt棉产生抗性不 可避免目前棉铃虫对 Bt 棉抗性的检测方法大多是在生物测定的基础上发展而 来的，本文对主要的 5种检测方法进行了综述选择可靠的抗性检测方法可准确 监测棉铃虫对 Bt 抗虫棉的敏感性水平并及时进行田间抗性早期预警关键词：棉铃虫；Bt毒素；转Bt基因棉花；抗性检测技术棉铃虫Helicoverpa armigera (Hubner)是广泛分布于我国各地区的一种重 要农业害虫，也是一种世界性害虫寄主种类众多，囊括了多种常见作物 20 世纪90年代初，棉铃虫在我国几乎连年爆发，造成了巨大的经济损失由于化 学农药尤其是拟除虫菊酯类农药的大量使用，棉铃虫几乎对所有化学农药都产生 了不同程度的抗性种植转基因Bt棉花成为目前控制棉铃虫发展的最有效方法 1997年，中国开始种植转Bt基因抗虫棉，2013年成为第二大转Bt基因抗虫棉 种植国，种植面积达到420万公顷。
转Bt基因抗虫棉的种植，有效地控制了棉 铃虫的为害，但长期种植抗虫棉也带来棉铃虫对Bt毒蛋白产生抗性的风险⑴ 对棉铃虫田间种群进行早期的抗性监测，能够避免因棉铃虫产生抗性而对我国经 济造成巨大损失1 棉铃虫对对转基因棉花的抗性检测技术目前对棉铃虫 Bt 抗性检测的技术主要有：剂量对数-死亡机率值法、区分剂 量法、F2代单雌系浓缩法、单对杂交法、Bt棉叶直接检测法和分子生物学检测 法［2］1.1 剂量对数-死亡机率值法剂量对数-死亡机率值法即抗性倍数法，是衍生于传统的农药毒力测定方法， 广泛用于各种害虫对化学农药的抗药性检测吴益东按机率值分析法计算毒力回 归式和致死中量，将各种药剂的ld50值与相应的相对敏感毒力基线的ld50值比 较, 计算出抗性倍数，于 1990-1993 年连续四年对位于冀、鲁、豫三省交界处抗 性中心区的山东省阳谷县棉铃虫的抗药性进行了系统监测［3］张雪燕等利用建立 毒力曲线测定了云南通海小菜蛾种群对阿维菌素的抗药性，得到抗药性增至 46.1倍, 昆明种群对阿维菌素的敏感性有所下降［4］王冬兰等按浓度对数和死亡 概率值分析法进行数据回归处理，得出毒力回归方程、致死中浓度(lc50 )值及 抗性倍数，测定了江苏省赣榆县(苏北) 、姜堰市(苏中) 、武进市(苏南) 三地 区禾谷缢管蚜和麦长管蚜对吡虫啉的敏感性［5］；刘永杰等利用毒力回归曲线测定 了山东泰安市郊区甜菜夜蛾田间种群对包括氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯马拉硫磷 等 11 种杀虫剂的抗药性［6］。
此方法通过适合的剂量梯度得到各剂量下靶标害虫的校正死亡率，并转化为 死亡几率值，从而使剂量-死亡率的 S 型曲线变成具有线性关系的剂量对数-死亡 机率值曲线，即田间种群的毒力回归曲线通过与敏感品系的敏感基线比较来确 定抗性的倍数，抗性倍数二测定种群的ld50/敏感种群的ld50剂量对数-死亡机率值法的优点是利用较少的虫源量方便快速地得到需要的 数据毒力回归曲线能够较全面地得到 LD50、LD90、LD99 等统计数据，为估测抗 性水平，获得诊断剂量等提供较准确依据在短时间内了解到测定种群抗药性的 发展，化学药剂的杀虫活性，衡量后续研究是否有意义但该方法测定群体中大 多数个体对药剂的反应，往往忽略了群体中少数抗性个体的反应，比较合适检测 中高频率的抗性水平，在抗性个体频率很低时 ,剂量对数—死亡机率值曲线中 ld50和斜率值不会随抗性个体频率的微小变化而产生明显的改变而当抗性个体 频率较高时，群体的LD50值才会有明显的变化，而这时候进行抗性治理已非常困 难因为由此测出的抗性水平往往具有滞后性，即往往难以实施预防性抗性治理 对策1.2 区分剂量法区分剂量法是在标准生物测定的基础上发展而来，通常情况下使用杀死 99% 敏感个体的剂量作为诊断剂量，此浓度下存活的个体为此剂量所区分的抗性个体， 该法检测的灵敏度在 10-2以上，以该方法进行的诊断试验来检测低频率抗性,比 剂量对数-死亡机率值反应标准方法更为有效 ［7］。
诊断剂量能够一次性杀死敏感 个体，准确获得抗性个体，并且结合棉铃虫抗性遗传机制能够获得所需要的基因 型，从而判断亲本个体基因型，得到抗性基因频率 Gould F 证明从田间采集的 雄性个体中存在的隐性或不完全显性等位基因,所用的后代是同型纯合的或对抗 性突变因子杂合的,在用区分剂量决定其后代基因型后 ,可以推断出带有抗性突 变因子的雄性父本的数量［11］区分剂量法在历史上的应用起始于害虫对化学农药抗性的测定上 Davidson 在 1960 年即认识到用区分剂量法测定杂合子种群抗性的重要性澳大利亚从 1983-1984 棉花生长季就决定开始使用区分剂量法我国于 1983 年开始试用区 分剂量法监测棉铃虫对化学农药例如拟除虫菊酯农药的抗性而在生物农药 Bt 毒素方面，Msacarenhas等报道了用诊断剂量130》g/mL测定得到田间大豆尺夜 蛾 Pseudoplusia includens (Walker) 相对于对照品系对 Bt Conder XL 的敏感 性低［12］而卢美光等已将此方法用于棉铃虫对 Bt 毒素 Cry1Ac 的抗性监测中， 其 1998 年检测了山东高密、河北邱县等华北地区棉田棉铃虫的抗性个体频率， 得到山东高密抗性个体频率为 0.9%，其他地区为0［8］。
此方法准确性较高，但存在三个缺陷：首先，诊断剂量处理可迅速得到抗性 个体，但诊断剂量的获得却需要进行大量的实验工作棉铃虫田间种群的抗性个 体基因型多样，需要根据预测选择合适的剂量进行区分，而此剂量需要连续的剂 量梯度毒力实验及生物测定获得，其准确性需要大量的试虫基数及毒素基数保证 其次，无法明确地指出抗性程度，来为后续研究提供比对区分剂量测定只是单 一地进行抗性筛选，获得抗性个体频率，无法通过比较获得抗性程度最后，不 能估计浓度- 死亡曲线，得到的具有统计学意义的数据指标过于单一区分剂量法一般与其它监测方法混合使用，陈海燕等在改进的 F1 筛选法中 使用区分剂量2.5》g/cm2对田间棉铃虫F1代中所期望的基因型(rr)进行检 测,以推知其亲本基因型［9］区分剂量法最实用于当抗性是常见的或被一个显性 等位基因所控制的抗性个体,即此法的使用主要取决于区分剂量与基因型关系的 准确性1.3 F2 代单雌系浓缩法F2 代单雌系浓缩法即利用种群内单雌系同胞交配以浓缩低频率的抗性基因， 通过对 F2 代的检测来确定亲本基因型，进行抗性监测的方法此方法被 Andow 和Alstad提出并用于监测欧洲玉米螟(Ostrinianubilalis)对转Bt基因棉的 抗性，得到抗性主效基因频率为 0.27%[15]。
他们将此方法描述为从田间采集大量 已交配过的雌成虫以建立单雌系；室内饲养至产生后代，单雌系产生的 F1 代在 人工饲料上饲养到成虫，单雌系内进行同胞交配；通过区分剂量检测F2代抗性 个体频率的分布,确定来自田间的雌成虫的抗性基因型 ,从而估算出抗性基因频 率；并且需要对 F2 代筛选得到抗性单雌系继续用区分剂量核查筛选确定真阳性 单雌系每个交配过的雌虫携带有至少4个配子体(2个是其自身的，2个来自其配偶) 每个单雌系包含有四个等位基因型，通过孟德尔遗传规律知，如果田间采集的雌 成虫具备一个抗性基因(rs),理论上其F2代大约会有1/16的抗性纯合子(rr), 所以该方法能够检测隐性杂合子抗性而对于隐形纯合子抗性及显性抗性，也可 以确定来自田间的雌成虫的抗性基因型,从而估算出抗性等位基因和抗性基因频 率该方法既可以检测隐性抗性基因,也可以检测显性抗性基因该方法已经广泛地应用于多种害虫对转基因作物的抗性监测中，并且在应用 中不断地进行相应的改进何丹军等应用 F2 代单雌系浓缩方法, 检测到河北省 邱县大田棉铃虫对转Bt基因棉的抗性等位基因频率〉5. 8X10-3,论证了单雌系 F2 代抗性检测技术的可行性[10,] 并为抗性治理对策的实施提供依据。
而为了更有效的降低成本和提高筛选效率，在田间直接采集虫卵或雌雄成虫 进行群交获得卵，进行一次区分剂量筛选，去除 ss 敏感个体，获得带有抗性基 因的个体，饲养至成虫后与室内敏感品系配单对交配后得到 F1 代，同胞交配获 得并检测 F2 代此改进能够保证抗性存在的准确性，不再需要进行假阳性测验， 对显性及隐性遗传检测都很方便，并且能够进一步地浓缩抗性基因F2 代单雌系浓缩法灵敏度高，应用范围广泛，但其缺点也制约着自身的大 面积推广为了克服假阴性的出现，需要从田间采集大量的成虫来建立大量的单 雌系，要求大量的人力物力，工作量极大；并且检测过程需要饲养至F2代以上， 历经的周期时间长；对单雌系的饲养、收卵，F1代的同胞交配，F2代的大量筛 选都需要严格的饲养条件，以保证虫量充足，抗性基因不丢失总之，该方法成 本是巨大的，需要更进一步的简化，对田间棉铃虫对转Bt基因棉抗性等位基因频 率的变化作出快速反应1.4 单对杂交法单对杂交法又称为 F1 代筛选法，是基于孟德尔遗传规律提出的检测方法Gould等对采自美国4个州的2 000多头烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)雄 蛾与实验室 Bt 抗性品系雌蛾进行杂交, 估算出田间种群的抗性等位基因频率为1.5 X10-3[ii]。
其提出的单对杂交Fl代法描述为利用室内筛选出的抗性纯合品 系与田间采集的雄性个体进行单对杂交，利用区分剂量对产生的F1代处理，获 得抗性纯合子，来评估大田种群的抗性等位基因频率随着不同害虫抗性遗传方 式的研究，该方法被普遍应用于各种害虫的抗药性研究中刘凤沂等 2005 年采 用 F1 代法估测了河北省邱县棉铃虫对 Bt 棉的抗性等位基因频率分别为 0. 047 (95 %CI :0. 015-0. 079)［i2］其2006年采用Fl代法在室内用Bt棉叶喂饲法 又检测了河北省邱县 Bt 棉田棉铃虫对 Bt 棉的抗性等位基因频率,估测抗性等 位基因频率为0. 94 (95 %CI : 0.044-0.145)［13］,该值为在国内首次检测到的高 抗性等位基因频率在传统 F1 代检测法基础上，根据不同需要也对此方法进行了相应的变形 Burd 等从田间采集美洲棉铃虫 Helicoverpa zea (Boddie) 雌成虫建立单雌系,直接检测了 F1 代幼虫的抗性,该方法适合于检测非隐性抗性基因［24］而陈海燕 等采用改进的Fl代法检测河南安阳和河北沧县棉铃虫种群抗性基因频率分别为 1.4X10-3和1.5X 10-3［14］，认为这两个地区棉铃虫种群敏感性没有变化。
其描述 为采集田间棉铃虫卵，在室内用人工饲料饲养至2龄幼虫，用1“g/cm2的CrylAc 活化毒素进行初筛,将初筛存活成虫与室内筛选的高抗纯合品系单对杂交 ,用区 分剂量对 F1 代进行检测此方法通过初筛对抗性基因库进行浓缩大大减少工作 量， 而且初筛后的雌、雄成虫都可以用来与室内抗性品系的成虫进行杂交F1 代检测法检测隐性抗性等位基因频率的灵敏度，比常规生测方法至少提 高了一个数量级以上，减少了检测的成本；并且检测时间相比F2代筛选法整整 缩短了一个世代，因而需饲养的虫数和饲养的工作量大大减少，进一步减少了检 测成本 但该方法的局限性也很明显：首先，实验室内需要有筛选的高抗纯合 品系；且抗性的遗传方式，包括抗性等位基因的频率、数目、显隐性程度均须明 确 Gould 等便是假设抗性是隐性的，并且是常。