第四章第四章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构 主要内容主要内容•1 1、蛋白质的大小、蛋白质的大小•2 2、蛋白质结构层次、蛋白质结构层次•3 3、肽、肽•4 4、蛋白质一级结构的测定、蛋白质一级结构的测定•5 5、蛋白质一级结构举例、蛋白质一级结构举例•6 6、蛋白质序列数据库、蛋白质序列数据库•7 7、固相肽合成、固相肽合成第四章第四章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构 一、蛋白质的大小一、蛋白质的大小 蛋白质是相对分子量很大的生物蛋白质是相对分子量很大的生物分子对任一种给定的蛋白质来说，分子对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓同的，即所谓均一的蛋白质均一的蛋白质4.1 4.1 蛋白质的分子大小蛋白质的分子大小 •蛋白质分子量的上下限是人为规定的，蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义一般规定最小的蛋白质是胰岛素，一般规定最小的蛋白质是胰岛素，相对分子量为相对分子量为5.7K5.7K。
•某些蛋白质是由两个或更多个多肽链通某些蛋白质是由两个或更多个多肽链通过过非共价键非共价键结合而成的，称寡聚蛋白质结合而成的，称寡聚蛋白质每条多肽链称为亚基或亚单位每条多肽链称为亚基或亚单位有些寡有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万4.1 4.1 蛋白质的大小蛋白质的大小 二、蛋白质结构层次二、蛋白质结构层次4.2 4.2 蛋白质结构层次蛋白质结构层次 •A description of all covalent bonds (mainly peptide bonds and disulfide bonds) linking amino acid residues in a polypeptide chain is its primary structure. The most important element of primary structure is the sequence of amino acid residues. •Secondary structure refers to particularly stable arrangements of amino acid residues giving rise to recurring structural patterns. •Tertiary structure describes all aspects of the three-dimensional folding of a polypeptide. •When a protein has two or more polypeptide subunits, their arrangement in space is referred to as quaternary structure.4.2 4.2 蛋白质结构层次蛋白质结构层次 三、三、 肽肽PEPTIDE4.3 4.3 肽肽1、肽与肽键结构、肽与肽键结构 蛋白质中氨基酸之间的基本连接为肽键（蛋白质中氨基酸之间的基本连接为肽键（peptide bond））,除此之外还有二硫键（除此之外还有二硫键（disulfide bond）。
肽键的形成 4.3 4.3 肽肽1、肽与肽键结构、肽与肽键结构某五肽某五肽命名：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸命名：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu 4.3 4.3 肽肽1、肽与肽键结构、肽与肽键结构肽平面（酰胺平面）：由六个原子组成（肽平面（酰胺平面）：由六个原子组成（2Cαα、、C、、H、、O、、N））C-N具有部分双键性质具有部分双键性质 4.34.3肽肽1、肽与肽键结构、肽与肽键结构C-N具有部分双键性质具有部分双键性质 4.3 4.3 肽肽2、肽的理化性质、肽的理化性质□□肽晶体的熔点均较高；肽晶体的熔点均较高；□□肽的酸碱性质主要处决于游离末端肽的酸碱性质主要处决于游离末端α-NH2和和α-COOH及及 侧链侧链R R基的可解离功能基团；在长肽上主要是侧链上的；基的可解离功能基团；在长肽上主要是侧链上的；□□小肽的滴定曲线与氨基酸相似；小肽的滴定曲线与氨基酸相似；□□肽的化学反应与氨基酸相似；肽的化学反应与氨基酸相似；□□双缩脲反应是二个或二个以上肽键化合物所特有的反应；双缩脲反应是二个或二个以上肽键化合物所特有的反应；□□小肽的旋光度约等于组成氨基酸的旋光度之和；小肽的旋光度约等于组成氨基酸的旋光度之和； 4.34.3肽肽双缩脲反应:当脲（即尿素）加热到当脲（即尿素）加热到180℃180℃时，两分子脲缩合，放出一分子氨而时，两分子脲缩合，放出一分子氨而形成双缩脲，然后在碱性溶液中与形成双缩脲，然后在碱性溶液中与CuCu2+2+结合生成复杂的紫红色结合生成复杂的紫红色化合物。
化合物 Cu2+ 4.34.3肽肽3、天然存在的活性肽、天然存在的活性肽GSH（谷胱甘肽（谷胱甘肽, Glutathione））Gamma-Glu-L-Cys-Gly 1.Glu的γ-COOH与Cys的NH2成键2.生理条件下GSH带负电荷，不易穿过细胞膜3.GSH的-SH基团可以解离出还原性H+和e-，与活性氧结合，自身可被氧化成GSSG,从而在细胞中发挥重要的抗氧化功能4.GSH的-SH基团还可以与多种重金属直接络合，从而发挥解毒作用4.3 4.3 肽肽GSHGSH的结构与反应特点：的结构与反应特点： GSHGSH过氧过氧化物酶化物酶H H2 2O O2 2 2GSH 2GSH 2H2H2 2O O GSSG GSSG GSH GSH还原酶还原酶NADPHNADPH+H H+ + NADPNADP+ + 4.34.3肽肽 •GSH is essential for the immune system to exert its full potential, e.g. (1) modulating antigen presentation to lymphocytes, thereby influencing cytokine production and type of response (cellular or humoral) that develops, (2) enhancing proliferation of lymphocytes thereby increasing magnitude of response, (3) enhancing killing activity of cytotoxic T cells and NK cells, and (4) regulating apoptosis, thereby maintaining control of the immune response. •GSH plays a fundamental role in numerous metabolic and biochemical reactions such as DNA synthesis and repair, protein synthesis, prostaglandin synthesis, amino acid transport and enzyme activation. Thus, every system in the body can be affected by the state of the glutathione system, especially the immune system, the nervous system, the gastrointestinal system and the lungs. 4.3 4.3 肽肽GSHGSH的其它生理功能：的其它生理功能： 四、蛋白质一级结构的测定四、蛋白质一级结构的测定 19691969年，国际纯粹与应用化学委员会年，国际纯粹与应用化学委员会（（IUPACIUPAC）规定：）规定：蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构指蛋指蛋白质多肽连中氨基酸的排列顺序，包括白质多肽连中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置。
其中最重要的是多肽链二硫键的位置其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 牛牛胰胰腺腺核核糖糖核核酸酸酶酶A A的的一一级级结结构构4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定•蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础自从基础自从19531953年年F.SangerF.Sanger测定了胰岛素的一测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定一级结构被测定• 氨基酸序列测定有直接法和间接法两种：氨基酸序列测定有直接法和间接法两种：直接直接法法，用酶和特异性试剂直接作用于蛋白质而测，用酶和特异性试剂直接作用于蛋白质而测定出氨基酸顺序；定出氨基酸顺序；间接法间接法，通过测定蛋白质之，通过测定蛋白质之基因的核苷酸顺序，用遗传密码来推断氨基酸基因的核苷酸顺序，用遗传密码来推断氨基酸的顺序这是因为核苷酸的测序比蛋白质的测的顺序这是因为核苷酸的测序比蛋白质的测序工作要更方便、更准确。
序工作要更方便、更准确 4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 第一步、前期准备第一步、前期准备•分离纯化蛋白质分离纯化蛋白质 （（ 纯度纯度>97%>97%以上）以上）•蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定 （电泳法、凝胶过（电泳法、凝胶过滤法、超离心法等滤法、超离心法等 ））4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 第二步、多肽链的数目测定与拆分第二步、多肽链的数目测定与拆分A A、测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质摩尔数之间的关系，即可确定多肽白质摩尔数之间的关系，即可确定多肽链的数目链的数目4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 B.B.多肽链的拆分多肽链的拆分 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分须先进行拆分4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 对于借助对于借助非共价键非共价键连接在一起的几连接在一起的几条多肽链，如，四聚体血红蛋白，条多肽链，如，四聚体血红蛋白，可用可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍处盐酸胍处理，即可分开多肽链理，即可分开多肽链( (亚基亚基).).4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 对于几条多肽链通过对于几条多肽链通过二硫键二硫键交联在一起交联在一起的。
可在的可在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍存盐酸胍存在下，在下，用过量的用过量的 - -巯基乙醇巯基乙醇( (还原法还原法) )处处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（化试剂（ICHICH2 2COOHCOOH）保护生成的巯基，以）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化防止它重新被氧化 也可应用也可应用过甲酸氧化法过甲酸氧化法拆分多肽链间的拆分多肽链间的二硫键二硫键4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 第三步、蛋白质的氨基酸组成分析第三步、蛋白质的氨基酸组成分析•首先用首先用6M HCl6M HCl将蛋白质样品水解将蛋白质样品水解•水解后样品用离子交换色谱分离，然后水解后样品用离子交换色谱分离，然后与茚三酮反应后，被检测器定量检测与茚三酮反应后，被检测器定量检测•也可通过反相也可通过反相HPLCHPLC分离检测方法是先分离检测方法是先将样品与将样品与EdmanEdman试剂（试剂（PITCPITC）反应，然后）反应，然后利用氨基酸侧链疏水性的差异进行分离利用氨基酸侧链疏水性的差异进行分离。
4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 第四步、分析多肽链的第四步、分析多肽链的N-末端和末端和C-末端末端•多肽链端基氨基酸分为两类：多肽链端基氨基酸分为两类：N-N-端氨基端氨基酸和酸和C-C-端氨基酸端氨基酸•N-N-端氨基酸和端氨基酸和C-C-端氨基酸分析的目的是端氨基酸分析的目的是建立两个重要的氨基酸序列参考点建立两个重要的氨基酸序列参考点4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 N-N-端氨基酸测定端氨基酸测定——DNFBDNFB法法•测定路线：测定路线：DNFB→DNP-DNFB→DNP-肽肽→→酸水解酸水解→→乙醚萃取乙醚萃取→→层析鉴定层析鉴定 •特点：特点：α-DNPα-DNP氨基酸容易和侧链氨基酸容易和侧链DNPDNP氨基酸分离氨基酸分离4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 N-N-端氨基酸测定端氨基酸测定——丹磺酰氯法丹磺酰氯法•测定路线：测定路线：DNS- DNS-DNS- DNS-肽肽→→酸水解酸水解→→乙醚萃取乙醚萃取→→层析鉴定层析鉴定 •特点：特点：DNS-DNS-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。
4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 N-N-端氨基酸测定端氨基酸测定——PITCPITC法法•测定路线：测定路线：PITC→PTC-PITC→PTC-肽肽→→PTH-PTH-氨基酸氨基酸→→乙醚乙醚萃取萃取→→层析鉴定层析鉴定 •特点：只切去特点：只切去N N端端- -氨基酸，其余肽端保持完整氨基酸，其余肽端保持完整4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 N-N-端氨基酸测定端氨基酸测定——氨肽酶法氨肽酶法•氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的链的N-N-端逐个的向里水解肽键端逐个的向里水解肽键•根据不同的反应时间测出酶水解所释放根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的知道蛋白质的N-N-末端残基顺序末端残基顺序•常用的有亮氨酸氨肽酶（水解常用的有亮氨酸氨肽酶（水解N-N-末端为末端为LeuLeu的肽键速度最快）、焦谷氨酸氨肽酶的肽键速度最快）、焦谷氨酸氨肽酶（水解（水解N-N-末端为焦谷氨酸，即环化的谷末端为焦谷氨酸，即环化的谷氨酸）。
氨酸）4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 •测定路线：多肽与肼在无水条件下加热，测定路线：多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端端氨基酸分离游离氨基酸分离游离C-C-端氨基酸可用端氨基酸可用DNFBDNFB法或法或DNSDNS法并通法并通过层析技术鉴定过层析技术鉴定•特点：是目前特点：是目前C-C-末端残基测定的最重要的化学方法，末端残基测定的最重要的化学方法，但但GlnGln、、AsnAsn、、CysCys被破坏，被破坏，C-C-末端的末端的ArgArg变成变成OrnOrn，不能，不能分析 C-C-端氨基酸测定端氨基酸测定——肼解法肼解法4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 C-末端鉴定末端鉴定——还原法还原法肽链肽链C-末端末端AA残基可用硼氢化锂还原成相应的残基可用硼氢化锂还原成相应的α-α-氨基醇然后用酸将肽完全水解，用层析法加以鉴定氨基醇然后用酸将肽完全水解，用层析法加以鉴定生成的生成的α-α-氨基醇。
氨基醇Sanger早期用此法鉴定胰岛素早期用此法鉴定胰岛素A、、B链的链的C-末端氨基酸残基末端氨基酸残基4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 C-C-端氨基酸测定端氨基酸测定——羧肽酶法羧肽酶法•羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-C-端逐个的水解端逐个的水解氨基酸氨基酸根据不同的反应时间测根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的知道蛋白质的C-C-末端残基顺序末端残基顺序•目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；；A A和和B B来来自胰脏；自胰脏；C C来自柑桔叶；来自柑桔叶；Y Y来自面包酵母来自面包酵母•羧肽酶羧肽酶A A能水解除能水解除Pro,ArgPro,Arg和和LysLys以外的所有以外的所有C-C-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；B B只能水解只能水解ArgArg和和LysLys为为C-C-末末端残基的肽键，羧肽酶端残基的肽键，羧肽酶Y Y 可作用于任何一个可作用于任何一个C-C-末端氨基酸残基。
末端氨基酸残基4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 Val- Ser- Gly A A、、多肽链断裂成多个肽段，可采用两种多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来第五步、多肽链的部分裂解和肽段混合第五步、多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化物的分离纯化B B、常用的断裂方法是：、常用的断裂方法是：酶裂解法酶裂解法和和化学化学裂解法4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 1、酶裂解法、酶裂解法•常用的蛋白水解酶包括：胰蛋白酶常用的蛋白水解酶包括：胰蛋白酶，，糜蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白糜蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶等酶，木瓜蛋白酶等•酶裂解的特点是：酶裂解的特点是：蛋白酶只裂解特蛋白酶只裂解特定的肽键定的肽键4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 A、胰蛋白酶（、胰蛋白酶（Trypsin））•仅作用于仅作用于ArgArg、、LysLys的羧基与别的氨基酸的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。
的氨基之间形成的肽键•产生的肽段数目等于多肽链中产生的肽段数目等于多肽链中ArgArg和和LysLys总数加总数加1 1（多肽链的（多肽链的C C末端肽段）末端肽段） 4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 B、糜蛋白酶（、糜蛋白酶（Chymotypsin））•专一性不如胰蛋白酶，作用于专一性不如胰蛋白酶，作用于TrpTrp、、TyrTyr、、PhePhe等疏水氨基酸的羧基与别的氨基酸的等疏水氨基酸的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键氨基之间形成的肽键•如疏水氨基酸为如疏水氨基酸为TrpTrp、、TyrTyr、、PhePhe时，水解时，水解快，为快，为LeuLeu，，MetMet和和HisHis时水解稍慢时水解稍慢4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 C、胃蛋白酶、胃蛋白酶•专一性与糜蛋白酶类似，但要求断裂点两侧的氨基酸都是疏水性氨基酸•最适pH为2糜蛋白酶为8-9）•确定二硫键位置时常用胃蛋白酶水解4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 2、化学裂解法、化学裂解法•化学裂解法获得的肽端一般都比较大，适化学裂解法获得的肽端一般都比较大，适合在自动序列仪种测定序列，因此，化学合在自动序列仪种测定序列，因此，化学法对相对分子量大的蛋白质序列测定是很法对相对分子量大的蛋白质序列测定是很重要的。
重要的•溴化氰断裂溴化氰断裂是最常用的化学断裂方法是最常用的化学断裂方法仅仅作用于作用于MetMet的羧基与别的氨基酸的氨基之的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键间形成的肽键 4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 •羟胺（羟胺（NHNH2 2OHOH）：）：专一性断裂专一性断裂-Asn-Asn- -Gly-Gly-之之间的肽键也能部分裂解间的肽键也能部分裂解-Asn-Asn- -Leu-Leu-之间之间的肽键以及的肽键以及-Asn-Asn- -Ala-Ala-之间的肽键之间的肽键4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 第六步、分离肽段，测定氨基酸序列第六步、分离肽段，测定氨基酸序列•多肽链用上述方法断裂后，所得的肽段混合物通常使用凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC等方法进行分离纯化•氨基酸序列测定主要使用Edman化学降解法，此外还有酶降解法、质谱法等4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 A、Edman化学降解法•Edman （（苯异硫氰酸酯法）苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析氨基酸顺序分析法实际上也是一种法实际上也是一种N-N-端分析法。
此法的特点端分析法此法的特点是能够不断重复循环，将肽链是能够不断重复循环，将肽链N-N-端氨基酸残端氨基酸残基逐一进行解离基逐一进行解离 氨氨基基酸酸序序列列测测定定仪仪测测序序过过程程示示意意图图 B、质谱法、质谱法•质谱法测序的优质谱法测序的优点是灵敏度高，点是灵敏度高，所需样品少，测所需样品少，测定速度快，蛋白定速度快，蛋白质的水解液经毛质的水解液经毛细管电泳或细管电泳或HPLCHPLC分离后直接进样分离后直接进样MS/MSMS/MS，免去繁重，免去繁重的肽分离纯化工的肽分离纯化工作 质谱测定的基本步骤质谱测定的基本步骤——电离电离•a a）蛋白质溶液在高电场中通过毛细管静电喷射，形成）蛋白质溶液在高电场中通过毛细管静电喷射，形成携带高电荷的微滴；携带高电荷的微滴；b b）蛋白质分子从微滴中被解吸进）蛋白质分子从微滴中被解吸进入气相；入气相；c c）蛋白质离子进入质谱进行分析蛋白质离子进入质谱进行分析 多肽分子量的确定多肽分子量的确定•用计算机分析多肽核质比数据，得出多肽的准用计算机分析多肽核质比数据，得出多肽的准确分子量确分子量 •选定的多肽在碰撞池中裂解成更小的离子碎片，进入第二选定的多肽在碰撞池中裂解成更小的离子碎片，进入第二台质谱仪进行分析。
台质谱仪进行分析•裂解主要发生在多肽中连接相继氨基酸的肽键上，因此产裂解主要发生在多肽中连接相继氨基酸的肽键上，因此产生的碎片代表一套大小只差一个氨基酸残基的肽段生的碎片代表一套大小只差一个氨基酸残基的肽段质谱测定的基本步骤质谱测定的基本步骤——二级电离二级电离 第七步、肽段在多肽链中位置的第七步、肽段在多肽链中位置的确定确定•利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序基酸顺序4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 示例示例( (十六肽的水解十六肽的水解) )•所得资料：Ｎ端：所得资料：Ｎ端：H H，， Ｃ端：ＳＣ端：Ｓ Ａ法裂解：Ａ法裂解：DNS PS EDVE RLA HDWT Ｂ法裂解：Ｂ法裂解：SED WTDN VERL APS HD•重叠法确定序列重叠法确定序列: :HDWTAPSWTDNRLADNSVERLEDVE4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 第八步、确定二硫键位置第八步、确定二硫键位置•一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链肽链( (切点多；酸性环境下防止二硫键发生交切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换换) )。
•将所得的肽段利用将所得的肽段利用BrownBrown及及HartlayHartlay的对的对角线电泳技术进行分离角线电泳技术进行分离•然后同其它方法分析的肽段进行比较，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置确定二硫键的位置4.4 4.4 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 对角线电泳对角线电泳技术技术•a) a) 混合肽段点到滤混合肽段点到滤纸中央•b) b) 第一向电泳，将第一向电泳，将产物分开产物分开•c) c) 用过甲酸将二硫用过甲酸将二硫键打断键打断•d) d) 进行第二向电泳进行第二向电泳•e) e) 偏离对角线的样偏离对角线的样品就是含二硫键的品就是含二硫键的片段片段 EXERCISE 1一一A肽由肽由Lys/His/Asp/2Glu/Ala/Val/Tyr组成；（组成；（1）此肽与）此肽与FDNB反应得反应得DNP-Asp；（；（2）此肽用羧肽酶）此肽用羧肽酶A处理得游离处理得游离Val；；（（3）此肽经胰蛋白酶水解，得二种肽，其中一种（）此肽经胰蛋白酶水解，得二种肽，其中一种（Lys/Asp/Glu/Ala/Tyr）在）在pH6.4时净电荷为时净电荷为0；另一种（；另一种（His/Glu/Val））可给出可给出DNP-His，在，在pH6.4时带正电荷；（时带正电荷；（4）此肽经糜蛋白酶）此肽经糜蛋白酶水解也得二种肽，其中一种（水解也得二种肽，其中一种（Asp/Ala/Tyr）在）在pH6.4时呈电中时呈电中性，另一种（性，另一种（Lys/His/2Glu/Val）在）在pH6.4时带正电荷。
时带正电荷试推断此肽的氨基酸顺序试推断此肽的氨基酸顺序 解：解：a.由（由（1）知：此肽）知：此肽N-末端为末端为Asp（（Asn））；； b.由（由（2）知：此肽）知：此肽C-末端为末端为Val；； c.由（由（3）第二种肽知小肽的顺序为：）第二种肽知小肽的顺序为：His-Gln-Val；； （此肽的（此肽的pI=6.4，净电荷，净电荷=0）） d.由（由（3）第一肽知此小肽的）第一肽知此小肽的C-末端为末端为Lys（由胰蛋白（由胰蛋白酶性质决定），由其净电荷为酶性质决定），由其净电荷为0可知可知Asp和和Glu仅有一个为仅有一个为酰氨形式酰氨形式，因，因Lys带正电荷；带正电荷； e.由（由（4）第一肽知此小肽的顺序：）第一肽知此小肽的顺序：Asn-Ala-Tyr （（pH6.4时电荷为时电荷为0知知Asn；糜蛋白酶水解知；糜蛋白酶水解知C-Tyr）；）； f. 由（由（4）第二肽知此小肽中有一）第二肽知此小肽中有一Glu为酰氨形式；且综为酰氨形式；且综合合b.c.d知此小肽的知此小肽的 顺序为：顺序为：Glu-Lys-His-Gln-Val；； g.综合综合e和和f知此知此A肽的氨基酸顺序为：肽的氨基酸顺序为： Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val EXERCISE 2有一缓激肽组成顺序为有一缓激肽组成顺序为Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg，试问经（，试问经（1）羧肽酶）羧肽酶B；（；（2）糜蛋白酶；（）糜蛋白酶；（3））胰蛋白酶；（胰蛋白酶；（4））DNFB作用后生成的肽或氨基酸是什么？作用后生成的肽或氨基酸是什么？解：（解：（1）得）得Arg和多肽和多肽Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro- Phe；； （（2）得）得Arg-Pro-Pro-Gly-Phe和和Ser-Pro-Phe和和Arg；； （（3）不能被胰蛋白酶水解；）不能被胰蛋白酶水解； （（4）得）得DNP-Arg和和Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe- Arg 五、五、 蛋白质一级结构举例蛋白质一级结构举例4.5 4.5 蛋白质一级结构举例蛋白质一级结构举例胰岛素(Insulin)p是胰岛是胰岛ββ细胞分泌的一种激素细胞分泌的一种激素p由由A A、、B B两个肽链组成。
人胰岛素两个肽链组成人胰岛素(Insulin (Insulin Human)AHuman)A链有链有2121个氨基酸，个氨基酸，B B链有链有3030个氨基酸组个氨基酸组成其中A7(Cys)-B7(Cys)A7(Cys)-B7(Cys)、、A20(Cys)-A20(Cys)-B19(Cys)B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使键，使A A、、B B两链连接起来此外两链连接起来此外A A链中链中A6(Cys)A6(Cys)与与A11(Cys)A11(Cys)之间也存在一个二硫键之间也存在一个二硫键 在胰岛β细胞核糖体上，胰岛素mRNA首先转译成由105个氨基酸残基构成的前胰岛素原（Preproinsulin）经信号肽信号肽引导进入内质网腔后，前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成86个氨基酸组成的含三个二硫键的长肽链—胰岛素原（Proinsulin）胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，经胰岛素原转化酶和羧肽酶E的作用，切去31、32、60三个精氨酸连接的链，断链生成没有作用的C肽，同时生成胰岛素，分泌到B细胞外，进入血液循环中4.5 4.5 蛋白质一级结构举例蛋白质一级结构举例 六、蛋白质序列数据库4.6 4.6 蛋白质序列数据库蛋白质序列数据库http://pir.georgetown.edu/pirwww/about/brochure.pdf 4.6 4.6 蛋白质序列数据库蛋白质序列数据库 七、固相肽的合成•1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)•包括挂接，去保护，活化，缩合，裂解五个步骤•氨基保护剂：叔丁氧甲酰基（BOC）,9-芴甲氧羰基（Fmoc）4.7 4.7 固相肽的合成固相肽的合成R. B. Merrifield (1963). "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide". J. Am. Chem. Soc. 85 (14): 2149–2154 。