单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质组学,浙江大学,生命科学学院,江 辉,密码：shenghua,第二章 二维电泳与蛋白质分离,一、蛋白质的提取与样品制备,二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳维等电聚焦电泳,三、胶上蛋白质检测技术,蛋白质染色方法,胶内：考马斯亮蓝R-250(CBB R-250)、CBB G-250、银染、负染、荧光染料染色以及放射性同位素标记等,转移到膜（PVDF、硝酸纤维素膜）上：酰胺黑(Amido Black)、丽春红S(Ponceau S),（一）考染（考马氏亮蓝染色）,1、考马氏亮蓝与蛋白质反应机理,考马氏亮蓝（Coomassie brilliant blue）是一类三苯基甲烷衍生物分为R-250（红兰色）、R-350（红兰色）、G-250（蓝绿色），它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物，在464-595nm有吸收峰（595nm 最大），且在比较宽的范围内（15-20,g,）扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系，因此可在595nm对蛋白质进行定量检测，而且在一定pH条件下，这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。
2、考染机理,胶体内染料和溶液中自由扩散染料间形成平衡后，溶液中少量自由染料穿透凝胶基质，有选择性地对蛋白质进行染色，而胶体态的染料排阻在胶外，阻止了背景的生成胶内蛋白质染色的关键是让蛋白质染色，而胶体不染色Coommassie Brilliant Blue G-250,3、考染程序,考染程序至少600多种，主要变换是将以下程序中的醋酸换成三氯乙酸、磷酸或高氯酸，但三氯乙酸易使谷氨酸羧基侧链不可逆酯化，造成肽谱数据复杂化1）固定：凝胶浸泡于50%乙醇+10%冰醋酸水溶液中，至少1h，可过夜2）染色：凝胶浸泡于染色液中至少2h染色液组成：45%甲醇+10%冰醋酸+0.25%考马氏亮蓝G-250，混均过滤3）脱色：多次更换脱色液，直至背景脱净，稍稍提高温度可加快脱色脱色液组成：25%乙醇+8%冰醋酸4）保存：凝胶脱色后水洗扫描备份，用保鲜膜包裹，一个月内进行质谱鉴定；长时间保存需将蛋白点切下，进一步脱色后贮于-804、,考染特点,（1）可以获得无背景或低背景的图谱；（2）染色过程需24-48h，所需时间较长；（3）灵敏度不高，为100-10ng，只能检测10-100ng 的蛋白质，低丰度的蛋白质难以显色。
二）银染,1、原理：,碱性银氨,（Ag(NH,3,),2,+,）染色法和,酸性硝酸银,（AgNO,3,）染色法酸性硝酸银染色法的原理是一个照相的过程，凝胶在酸性环境下与硝酸银温育，银离子附与蛋白质表面，然后在碱性环境下里用福尔马林还原成金属银碱性银氨染色法的原理是用氨水来形成银氨复合物，银氨复合物与胶内SDS-蛋白质复合物结合，然后在酸性条件下用福尔马林将银氨还原成金属银2、特点,（1）酸性银染染色背景浅、容易控制，对酸性蛋白质的染色灵敏度稍高；碱性银染灵敏度稍高，但背景深、不容易控制2）相对于考染，灵敏度高，可达200pg3）但由于存在戊二醛的特异性反应，对下一步的酶切肽谱提取存在困难；增敏过程蛋白质被部分提取至胶外3、程序,1.,分析型银染,（,碱性银氨法，,不能用于质谱鉴定）,(1),水洗胶,5 min,；,(2)40%,乙醇，,10%,乙酸固定,1 hr,；,(3)5%,乙醇，,5%,乙酸固定过夜；,(4),水洗,20 min,两遍；,(5)5%,戊二醛,1 h,；,(6),水洗,30 min，,四遍；,(7)250mL,新鲜配制的银氨液,(1mL NaOH,与,5mL,饱和氨水混合再加,10mL 20%AgNO,3,)/,胶,45 min,；,(8),水洗,3 min，,三遍；,(9)1.5 mL 1%,柠檬酸、,125L 37%,甲醛,/,胶显色；,(10)5%,乙酸停显,10min,；,(11),水洗,10 min,三遍。
2.,快速银染,（,酸性硝酸银法,，与质谱鉴定相匹配,）,（三）负染,1、特点,（1）负染能提高SDS-PAGE胶上蛋白质的回收率，常用有铜染、锌-咪唑染等负染色结果在凝胶表面产生半透明背景，而凝胶显示黑色背景或相应底色，蛋白质以透明形式被检测出来，而且蛋白质被很好地保存下来2）显色过程仅需5-15min（3）蛋白质易从胶上取出，一般用EDTA络合金属离子就可转移出蛋白质4）灵敏度15ng,2、原理（锌-咪唑染料）,咪唑存在时，自由或弱结合的锌离子以锌-咪唑形式沉淀下来，而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固而留在胶上，从而导致半透明背景上的空白区域，这就是负染过程人肝癌细胞系MHCC97的部分双向凝胶电泳锌染图谱,锌染程序,(1),水洗,1 min,；,(2)0.2 mol/L,咪唑、,0.1%SDS,溶液,10 min,；,(3)0.2 mol/L,氯化锌,1 min,；,(4),水洗,5 sec，,三遍；,（四）荧光染色（Cy3和Cy5）,1、原理：,利用荧光染料对蛋白质进行标记，在光激发下产生荧光，通过扫描得到图象比如用甲基Cy3与甲基Cy5两种染料分别对两个不同蛋白样品进行荧光标记，并在,一块2-DE胶,上进行运行，由于两种染料激发波长不同，扫描时可得到两张有差异的图象，因此可用于差异蛋白质组学研究。
2、特点,（1）灵敏度250pg与银染相近，但,线性范围,高于银染2）蛋白质被荧光共价修饰，改变了移动性能，降低了溶解性，导致质谱鉴定出现偏差3）不同样品由于所含蛋白质可被荧光修饰的功能基团数不一样，灵敏度变化不一样二维电泳荧光检测,Red Cy3,Green Cy5,（五）SYPRO Ruby荧光染色,基于钌的金属螯合染料,检测灵敏度0.51ng,染色速度快，15min可完成,线性动态范围广,需要紫外或激光检测系统,和质谱检测兼容,总结,染色方法,灵敏度,线性范围,与质谱兼容性,费用,硬件要求,考染,10ng,3,+,+,+,银染,200pg,7,+,+,+,负染,15ng,3,+,+,+,荧光标记,250pg,10,4,+,+,+,二维电泳的图象分析,图象分析,对双向电泳图谱上的这些蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类,主要包括：,图象采集,图象分析：蛋白质点检测、背景消除、蛋白点匹配、归一化处理、数据输出,数据库的建立,图象采集（image collection）,透射扫描方式,光密度扫描：考染、银染、负染,激光诱导荧光扫描：荧光染色,蛋白点检测（spot detection）,蛋白点定位、点形状、点丰度,参数设定：最模糊的点、最小的点、最大的点和胶的背景,背景消减（background subtraction）,凝胶染色（银染和考染）很难保证没有背景,需要将背景去除，才能得到真正的蛋白质点的丰度,人工消除,边界最低强度消减（沿检测点边界，取强度最低的点为背景）,边界平均象素值消减（取被检测点边界的平均强度为背景）,非点模式,归一化处理（normalization）,便于对不同胶上的同一蛋白质进行定量比较,基于全部点体积之和,基于某一个蛋白质点（标志蛋白、人为添加的参照蛋白）,凝胶匹配（matching）,不同凝胶上蛋白质点进行定量比较,参考凝胶,其中一张,几张合并后的平均胶,种子点（人工匹配）：选择明显对应的点使之匹配,2D数据库的建立,IPG胶条的应用，实现了2D电泳的重复性,大量标准2D电泳图谱的建立,氨基酸组成分析、肽质量指纹图谱建立、质谱技术发展，鉴定了大量的蛋白质,计算机和网络的发展,有效的管理、利用和共享这些数据,哺乳动物的2-DE数据库,酵母的2-DE数据库,植物的2-DE数据库,细菌和病毒的2-DE数据库,思考题,膜蛋白提取与分离最主要的困难是什么？为什么常用到去污剂？,简述二维电泳中一向IEF和二向SDS-PAGE的基本原理。
简述考染、银染、负染和荧光染色的基本原理并进行比较核酸，盐，去垢剂这三种物质对2D 胶的效果产生什么影响？,。