荧光定量 PCR 技术服务流程引物和探针的设计1. 公司专利的 Beacon 技术（针对 microRNA 的检测）a. 将mRNA序列转换成DNA序列取3'末端5〜6个碱基的区域，使之退火温 度达到16°C （按照A、T=2°C;C、G=4°C的原则计算）并用oligo 6写出mRNA 的反向互补序列方法：将序列粘贴至oligo 6，用“ Change ”选项中的 “ Strands”b. 正向引物的设计：先根据mRNA的部分序列设计正向引物,长度为15个碱基左右序列与mRNA 一致，5'端与mRNA的5'端起始碱基一致，使当前引物退火温度达到40〜42°C, 在引物的5'末端添加碱基，最终使引物退火温度达到56°C左右，计算原则同上 引物总长尽量短注意：检查正向引物自身形成的二聚体3'端互补不超过 3 个碱基c. Beacon 探针的设计：将mRNA反向互补序列的16C部分连同后面的2〜3个碱基（注意：这2〜3 个碱基与正向引物的重叠不超过三个碱基复制下来，然后在此序列前后部分别 添加相应的互补序列，作为“茎环结构”中的“茎”部分，此结构必须严格配对, 目前通用序列为CGCAGG和CCTGCG，可供参考。
在序列和前半部分的茎序 列之间应添加若干碱基，使Beacon探针的退火温度达到60C左右当然也可在此 序列后部和后半半部分的茎序列之间添加，但要注意和正向引物的重叠注意：用oligo 6软件不时的检査茎环结构是否存在，以及此探针和已设计完的正 向引物之间的二聚体情况d.茎环结构逆转录引物的设计：用Beacon探针的前部茎环节构序列参与“茎”的部分，即GGCCCTG和 GCCAGCG然后在反向引物和探针序列之间添加2〜3个碱基，长度在40个碱 基左右目前通用序列为：GGCCCTGACATCAGATGTGTTGGCT TACG+ 探针除了后半部分“茎”序列 的部分，可供参考注意：需检查所设计引物的结构情况e. 反向引物的设计：在上述茎环节构逆转录引物前端取20 个碱基左右的序列，作为反向引物的序 列，退火温度在54~56C例如：CATCAGATGTGTTGGCT ,可供参考 注意：设计完成之后，检査其自身互补、与正向引物和Beacon探针的互补情况2. 普通引物的设计（针对待检基因）a. 搜索基因相关信息根据客户所提供的基因编号，在NCBI上查出该基因的相关信息，以文本的形 式先保存下来b. 运用 oligo 6 设计相应的引物在上述从NCBI上摘录的信息中找到该基因的编码区位置，即“CDS”这一部分的 序列，将其复制下来，打开oligo 6把复制的序列粘贴上去，并“Accept”。
点击“Change”菜单选中第一项“Current Oligo Length”，设定其长度为20个碱基 然后选择“Search”选项的第一项“For Primers and Probes”，在弹出的对话框中 选中“Search Ranges”，把PCR产物的大小设为100〜150个碱基，最后点击“OK” 开始搜索c. 选择适当的引物一般应选择该序列中后部的引物，尽量靠近后部，再用'Analyze”选项里的 “Duplex Formation”分析正向引物之间、反向引物之间以及正反向引物之间的二 聚体形成情况，引物3'末端互补的碱基不超过 3个二. 客户样品组织或细胞样品a.收到样品后立即置于-80°C冰箱冷冻保存等到用时再取出，操作时尽量缩短 样品暴露在室温状态下的时间b・ Total RNA 抽提：往离心管中加入500ul Ezol，匀浆（如样品为细胞，则不需匀浆，直接加1ml Ezol至离 心管中）称取适量的组织样品（一般为10〜20mg左右，细胞样品则不需要称重 于2ml离心管中匀浆后补加500ul Ezol，将离心管上下颠倒混匀，室温放置10min加入 200ul RNA 专用的三氯甲烷，上下颠倒混匀，直至离心管中的液体彻底混匀，成 乳白色状。
室温放置 5min， 12000rpm/min 离心 15min小心将上清转移至另一干净的1.5ml离心管中，切勿吸动中层蛋白相和下层有机相 往上清中加入 500ul 预冷的 RNA 专用的异丙醇，室温放置 5min 10000rpm/min 离心 10min小心弃尽上清，加入1ml RNA专用的75%的乙醇洗涤沉淀，10000rpm/min离心10min 小心弃尽上清，置于室温晾干乙醇，加入适量的DEPC水溶解，混匀注意：上述步骤中所用离心管均经DEPC水处理试剂均为RNA专用试剂抽 提人员需带上手套和口罩用移液器吸上清时枪头切勿触碰RNA沉淀所在的一侧管 壁c. RNA 电泳： 将按上述步骤抽提的total RNA取适量的体积进行1 %琼脂糖凝胶电泳分析结果，评价抽提质量注意：完整的total RNA应包含清晰的28s, 18s和5s三条带形，28s与18s的总 量比应为 2： 1RNA 样品收到样品后立即置于-80°C冰箱冷冻保存等到用时再取出，操作时尽量缩短样品 暴露在室温状态下的时间cDNA 模板的制备Total RNA逆转录：将上述抽提得到的或者客户直接送来的total RNA进行逆转录，制备cDNA模板。
a. 逆转录体系：试剂名称（buffer和酶均为promega公司）用量/管5 X Reverse Transcription buffer （缓冲液）4ulRT Primer Mix （1uM）（引物混合液）1.25uldNTP （10mM（（四种脱氧核糖核苷酸混合液）0・75ulRNA （模板）根据total RNA的浓度以及检测的基因数定RTase （活力单位视不同规格而定）（逆转录 酶）0.5ulDEPC H2Oto 20ul注意：1.上述表格中RT Primer的终浓度为1uM,稀释均用DEPC水稀释2. 检测的样品包括1 “M miRNA标准品，1nM miRNA标准品和总RNA3. 表格中所提供的为逆转录20ul的体系，可根据实际需要按比例扩大该体系4・bufer与盨应的逆转录酶对应，如更换逆转录酶则需注意新的buffer浓度以 及逆转录酶的活力单位逆转录酶快用快放，保存于-20°C5. 可根据需要比相应的管数多配1〜2管的量6. 逆转录后的cDNA于-20C保存b. 逆转录反应条件：（1） 如用公叨专利的beacon技术，反应条件为：16C 30min； 42C 30min； 85C 10min。
一般逆转录则用42C 30min； 85C 10min即可 备注：所用仪器为 FTC-200 c. FTC-2000使用方法（逆转录时）：用公司专利的beacon技术时，直接运行名为miRNA-RT的程序普逊逆转录则直接运行名为RT-normal的程序荧光定量PCR检测cDNA 模板的稀释：将上述逆转录后得到的cDNA按自身需要进行稀释，考虑因素与cDNA的浓度以 及需要检测的基因数盨关通常情况下稀释 3 倍，例如：往 20ul 的体系中加入 40ul ddH2O2. 荧光定量 PCR：a.荧光定量PCR佃系（染料法）：试剂名称系（染料法）：A试剂名称用量/管2XSYBR PCR Master Mix10ulF Primer （20uM）（正向引物）0.2ulR Primer （20uM）（反向引物）0.2ulTemplate （模板）2ul （也可根据需要来调整）rTaq DNA polymerase （5U/ul）（聚合酶）0.2ulddH2Oto 20ul注意：1. 2XSYBR PCR Master Mix注意避光保存于4°C2. 引物终浓度为 200nM3. cDNA模板暂时不用时可放4C,如需过夜，则应放于-20C冻存。
4. rTaq酶快用快放，保存于-20C5. 如配的管数较多，由于移液器的误差，庄多配5〜6管6. 每个待检基因都需作三重复b.荧光宊量PCR体系（探针法）:试剂名称用量/管2XSYBR @CR Master Mix10ulF Primer （20eM）（正向引物）0.2ulR Primer （20uM）（反向引物）0.2ulTaqman probe （20uM）（探针）0.2ulTemplate （模板）2ul （也可根据需要来调整）rTaq DNA polymerase （5U/ul）（聚合酶）0.2ulddH2Oto 20ul注意：1. Taqman probe应避光保存，原倍浓度则还应放-"0C冻存，避免反复冻融2. 其余注意事项和上述染料法相同c.荧光定量PCR反应条件：（ !） 95C 3min；（2）95C 15s；（3） 50C 30s （温度可根据实际情况调整 4） 72C 30s；第2至第4步共40个循环 备注：所用仪器为 MX3000Pd. MX3000P 的使用： （1）开机器背部电源 （2）双击桌面上 MX3000P 的程序3） 在弹出的窗口中选择第一项：Quantitative PCR （Multiple Standards ”。
4） 选中“Setup”标签，在次级标签“Plate Setup”中根据所放样品的位置选 择相应的孔和适当的荧光种籫（我们公司现采用FAM检测，用ROX作为校准 荧光）5） 次级标签“Thermal Profile Setup”中选择合适的温度程序6） 设置完孔位和温度后，选中“Run”标签，点击工內栏上“lamp on/off”按钮，预热，在弹出的小对话框中选中“ lamp off at the end of run”，再点击“Start”选择合适的目录和文件名后在新弹出的对词框中点击“run now” 运行数据处理分析1. 文件中切出所用试剂以及检测方法；2. 将待检的样品名和基因名列成表格，填入三重复的Ct值，并求出平均值以及目 的样品和对照样品之间的一事比较参数，整理后发给客户。