单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,病毒的分离,样品的采集与保存,样品的处理,病毒的鸡胚接种,一、,样品的采集与保存,1.样品采集,机体尚未产生抗体之前的疾病急性期样品，尽可能新鲜，不同病毒病采集材料不同新城疫病毒-呼吸道分泌物、脑、脾,禽流感病毒-器官分泌物、泄殖腔内容物,马立克病毒-肿瘤组织、白细胞,传染性囊病病毒法氏囊、脾,传染性喉气管炎病毒气管分泌物、气管、肺,传染性支气管炎病毒-气管分泌物、肺、输卵管、肾,禽痘病毒-痘斑,脑脊髓炎病毒-脑脊髓,小鹅瘟病毒肝、脾、肾,鸭瘟病毒肝、脾、肾、血液,禽白血病病毒全血、血浆,鸡病毒性关节炎病毒滑液,网状内皮组织增生病病毒-脾、全血、肿瘤组织,2.样品的保存,多数病毒对热不稳定，应立即接种为好如需保存或运送，最后在冷条件下，48h送至实验室一般置50%中型甘油中，4保存如需保存时间较长，-20 以下保存2.研磨和稀释,研钵研磨，稀释液通常用生理盐水或Hanks液，制成10%-20%组织悬液有的也可反复冻融（如法氏囊病毒），再以2000r/min离心10-20min，吸取上清液供接种三、,病毒的鸡胚接种,实验室培养病毒常使用动物接种和鸡胚培养两种方法，而鸡胚培养更为常见。
一般而言，禽病毒病大部分可经鸡胚分离病毒，其他动物病如犬瘟热也可经鸡胚分离病毒应用于,（1）,禽痘病毒、传染性喉气管炎病毒及传染性法氏囊病毒的分离、鉴定和疫苗制备；（2）禽流感病毒、新城疫病毒及传染性支气管炎病毒的分离、诊断抗原和疫苗的制备不同病毒接种途径不一样一）实验目的,1.了解鸡胚培养有哪几种常用的接种方法2.掌握鸡胚尿囊腔接种培养鸡新城疫病毒的操作技术2.接种材料：,本实验采用,新城疫弱毒活疫苗,作试验用3.各种器材：,孵蛋器、照蛋器、蛋托、打孔器（锥子）、1ml注射器、4,1/2,针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、记号笔、固体石蜡、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管、灭菌平皿、试管、酒精灯三）实验方法,1.接种前的准备,（1）鸡胚准备,接种前用照蛋器观察是否为受精卵及其活力发育正常鸡胚，可见清晰的血管及活动的鸡胚未受精和死胚胚体固定在一端不动，看不到血管或血管消散，应剔除2）病毒材料的准备：,要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每1000羽份配成250ml,为达到无菌的目的，可在每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各100-5000IU，置室温中1h处理。
鸡胚的模式结构,1.卵壳 2.绒毛尿囊膜 3.尿囊腔,4.羊水腔 5.卵黄囊 6.鸡胚胎 7.卵白,尿囊腔接种,主要用于禽流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的分离、增殖、传代1）在照蛋器下，用铅笔勾出气室及胚胎的位置，并在尿囊膜血管较少的地方作记号2）消毒：用碘酒消毒气室蛋壳，酒精脱碘，,气室向上竖放于蛋托上，,用灭菌钢针或锥子在记号处打一孔3）接种病毒：用9针头1ml注射器吸取鸡新城疫病毒，针头通过打出的孔进针向鸡胚方向刺入0.5-1cm，注入0.10.2ml4）用融化的石蜡封闭小孔，39孵化器中孵化72h最适于分离和增殖斑点状或痘疱状病灶为特征的病毒，如禽痘病毒、传染性喉气管炎病毒等，传染性法氏囊病毒和鸭瘟病毒也用此法接种绒毛尿囊膜接种,取11-13日龄的鸡胚，照蛋划出气室、胎位在靠近气室端无大血管处做开窗标记，对标记处及周围消毒；将标记处击破蛋壳，,小心除去卵壳，但不可损伤壳膜，,形成1平方厘米的卵窗同时在气室中央钻一小孔随后用针尖轻轻挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊，滴加1滴灭菌生理盐水于刺破处用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴加壳膜上的生理盐水迅速渗入。
用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊上最后用透明胶密封卵窗气室中央小孔可用石蜡密封住横放鸡胚于孵化箱中，不许翻动，保持卵窗向上绒毛尿囊膜接种,绒毛尿囊膜接种,1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜,绒毛尿囊膜接种,主要用于禽流感病毒和新城疫病毒的分离增殖取10-12日龄的鸡胚，消毒气室顶上的蛋壳，并将气室顶端的蛋壳击破，用灭菌镊子揭去裂痕部位的蛋壳和壳膜，用灭菌平头镊子刺破尿囊膜，并轻轻夹去羊膜，用小号针头刺进羊膜腔内，注入0.05-0.1ml的病毒接种液，以氧化锌胶布封口，滴上溶化的固体石蜡放回孵化器，使蛋直立孵化羊膜腔接种,羊膜腔接种,1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜4.羊膜,羊膜腔接种,鸡胚的各种接种途径,1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种,3.羊水腔接种 4.卵黄囊接种,绒毛尿囊腔内接种,绒毛尿囊膜接种,羊膜腔接种,卵黄囊内接种,3.收毒：,病毒的收毒根据接种的途径而定尿 囊 液,绒毛尿囊膜,羊 水,卵黄液和卵黄膜,4.废料处理,操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦净后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚胎等残物煮沸消毒后弃去。