第五章 PCRPCR技术及其应用技术及其应用§1 PCR技术原理§2 PCR技术应用 第一节 PCR技术原理 一、PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶 解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长 PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物 PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶 PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明19711971年年，，KhoranaKhorana提提出出：：经经过过DNADNA变变性性，，与与合合适适引引物物杂杂交交，，用用DNADNA聚聚合合酶酶延延伸伸引引物物，，并不断重复该过程便可克隆并不断重复该过程便可克隆tRNAtRNA基因。
基因但但由由于于测测序序和和引引物物合合成成的的困困难难，，以以及及7070年年代代基基因因工工程程技技术术的的发发明明使使克克隆隆基基因因成成为为可可能能，，所所以以，，KhoranaKhorana的的设设想想被被人人们们遗遗忘了忘了…… PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明19851985年年，，美美国国PE-PE-CetusCetus公公司司的的MullisMullis等等人人发发明明了了聚聚合合酶酶链反应（链反应（PCRPCR））基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNADNA复制复制最最初初采采用用E-coli E-coli DNADNA聚聚合合酶酶进进行行PCRPCR，，由由于于该该酶酶不不耐耐热热，，使这一过程耗时，费力，且易出错使这一过程耗时，费力，且易出错耐耐热热DNADNA聚聚合合酶酶的的应应用用使使得得PCRPCR能能高高效效率率的的进进行行，，随随后后PE-PE-CetusCetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCRPCR自动化热循环仪自动化热循环仪19931993年，年，MullisMullis等因此项技术获诺贝尔化学奖等因此项技术获诺贝尔化学奖 Kary B. Mullis <>1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
国内复旦大学 1988 1988 年起开始研制耐热性多聚酶，军事医学科学院马立人教授等在 1989 1989 年研制成功了 PCR PCR 自动装置，并且不断推陈出新，最近研制的PTC51A/B PTC51A/B 型 DNA DNA 热循环仪体积小，造型美观，价格适宜，操作简单，尤为适宜国内应用 PCR PCR 发明不到 10 10 年，却已获得广泛应用目前，每年都有上千篇文章 发表1991 1991 年，期刊““PCR PCR 方法与应用””（PCrPCr Methods and Methods and ApplicationApplication）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊PCR PCR 技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度 1993 1993 年度诺贝尔化学将已于 10 10 月 13 13 日揭晓，KaryKary Mullis Mullis 因发明了““聚合酶链式反应””而获得此殊荣现在世界各地都在使用 PCR PCR 检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为精确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。
瑞典皇家科学院说：““PCR PCR 方法已经广泛应用于生物医学中该方法同 DNA DNA 测序法结合起来很可能将成为研究动植物分类学的一种革新工具一名加拿大籍英国科学家Michael Smith Michael Smith 因开创了““寡核苷酸基因定点诱变””的方法而与 Mullis Mullis 同享此荣 引物引物引物引物Mullis的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定特定特定DNADNADNADNA片段片段片段片段 72℃72℃94949494℃55℃55℃PCRPCR循环循环循环循环 二、PCR的基本原理类似于类似于DNADNA的体内复制首先待扩增的体内复制首先待扩增DNADNA模板模板加热加热变性变性解链，随之将反应混合物冷却至某解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生生退火退火，再将温度升高使退火引物在，再将温度升高使退火引物在DNADNA聚合聚合酶作用下得以酶作用下得以延伸延伸 这种热变性这种热变性- -复性复性- -延伸延伸的过程就是一个的过程就是一个PCRPCR循环，循环，PCRPCR就是在合适条就是在合适条件下的这种循环的不断重复。
件下的这种循环的不断重复 PCR Cycle - Step 1PCR Cycle - Step 1 - - DenaturationDenaturation Template Template DNA by Heat (95DNA by Heat (95o oC)C)Target SequenceTarget SequencePCR原理示意图原理示意图①①模板模板DNA的变性：模板的变性：模板DNA经加热至经加热至93℃左右一定时间后，使左右一定时间后，使模板模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；以便它与引物结合，为下轮反应作准备； PCR Cycle - Step 2 –PCR Cycle - Step 2 – Temperature is lowered (TTemperature is lowered (Tm m ) and primers anneal to ) and primers anneal to target sequencestarget sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 25’3’5’5’3’5’3’3’②②模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板DNA经加热变性成单链后，温经加热变性成单链后，温度降至度降至55℃左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合； PCR Cycle - Step 3 -PCR Cycle - Step 3 - At 72 At 72 o o C C TaqTaq DNA polymerase catalyses primer DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are extension as complementary nucleotides are incorporatedincorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 25’3’5’5’3’5’3’3’Taq DNAPolymerase③③引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板--引物结引物结合物在合物在TaqDNA聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dNTP为反应原料，为反应原料，靶序列为模板，按靶序列为模板，按碱基配对与半保留碱基配对与半保留复制原理，合成一复制原理，合成一条新的与模板条新的与模板DNA 链。
链 End of the 1st PCR Cycle –End of the 1st PCR Cycle – Results in two copies of target sequenceResults in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence每完成一个每完成一个循环需循环需2～～4分钟，分钟， 2～～3小时就能将小时就能将待扩目的基待扩目的基因扩增放大因扩增放大几百万倍几百万倍 Target AmplificationTarget AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon 三、PCR反应•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点标准的PCR反应条件：10X10X缓冲液 缓冲液 10 10 μL L4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各 各1010～～100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.1～～2μgTaqTaq DNA DNA聚合酶聚合酶 2.5U2.5UMgMg2+ 2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L PCR仪 PCR反应•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点 1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍 模板DNA95℃ PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点50℃引物1引物2DNA引物 PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶 PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点72℃第1轮结束第2轮开始 PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点72℃第2轮结束 PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR反应条件反应条件PCRPCR过程过程PCRPCR的特点的特点重复重复3030轮后轮后2 23030=1,073,741,824=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增 第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 PCR反应•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点灵敏度高灵敏度高1.1.皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量级扩增到微克量级扩增到微克( (ugug=10=10-6-6) )水平水平2.2.能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞3.3.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFU4.4.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速1.1.一次性加好反应液，一次性加好反应液，2 2～～4 4 小时完成扩增小时完成扩增2.2.扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提的粗提DNADNA 1）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类 一般100ng DNA模板/100L 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加四、PCR反应体系 （2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量 （4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性 （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度 2）循环参数(1)变性 (2) 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。
增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性 （3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 PCR产物的积累规律 在在PCRPCR反应中，反应中，DNADNA扩增过程遵循酶的催化扩增过程遵循酶的催化动力学原理反应初期，目的动力学原理反应初期，目的DNADNA片段呈指数扩增片段呈指数扩增随着目的随着目的DNADNA产物逐渐积累，在引物一模板与产物逐渐积累，在引物一模板与DNADNA聚聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增时扩增DNADNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现出现““停滞效应停滞效应””，又称，又称““平台期平台期””到达平台期到达平台期所需所需PCRPCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCRPCR扩增效率、扩增效率、DNADNA聚合酶种类和活性、以及非特异产聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。
到达平台期前，物的竞争等因素到达平台期前，TaqDNATaqDNA聚合酶一聚合酶一般要进行般要进行2525次以上次以上PCRPCR循环 多数情况下，平台期在多数情况下，平台期在PCRPCR反应中不可避免反应中不可避免 PCR产物的积累规律示意图 五、五、PCRPCR引物的设计一般原则引物的设计一般原则①①引引引引物物物物长长长长度度度度一一一一般般般般以以以以1818～～～～30bp30bp为为为为宜宜宜宜，，，，过过过过短短短短则则则则降降降降低低低低特特特特异异异异性性性性，，，，过过过过长长长长则则则则会会会会引引引引起起起起引引引引物物物物间间间间的的的的退退退退火火火火而而而而影影影影响响响响有有有有效效效效扩扩扩扩增增增增，，，，同同同同时时时时也增加引物合成的成本也增加引物合成的成本也增加引物合成的成本也增加引物合成的成本②②②②避避避避免免免免引引引引物物物物内内内内部部部部出出出出现现现现二二二二级级级级结结结结构构构构，，，，避避避避免免免免序序序序列列列列内内内内有有有有较较较较长长长长的的的的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。
回文结构，使引物自身不能形成发夹结构回文结构，使引物自身不能形成发夹结构③③③③G/CG/C和和和和A/TA/T碱碱碱碱基基基基均均均均匀匀匀匀分分分分布布布布，，，， G+CG+C含含含含量量量量在在在在4040～～～～60%60%之之之之间间间间，，，，引引引引物物物物碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列尽尽尽尽可可可可能能能能选选选选择择择择碱碱碱碱基基基基随随随随机机机机分分分分布布布布，，，，避避避避免免免免出现嘌呤或嘧啶连续排列出现嘌呤或嘧啶连续排列出现嘌呤或嘧啶连续排列出现嘌呤或嘧啶连续排列 ④④要要要要避避避避免免免免两两两两个个个个引引引引物物物物间间间间特特特特别别别别是是是是3`3`末末末末端端端端碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列互互互互补补补补以以以以及及及及同同同同一一一一引引引引物物物物自自自自身身身身3`3`末末末末端端端端碱碱碱碱基基基基序序序序列列列列互互互互补补补补的的的的，，，，使使使使它它它它们们们们不不不不能能能能形成引物二聚体或发卡结构形成引物二聚体或发卡结构形成引物二聚体或发卡结构形成引物二聚体或发卡结构⑤⑤⑤⑤引引引引物物物物3`3`末末末末端端端端碱碱碱碱基基基基一一一一般般般般应应应应与与与与模模模模板板板板DNADNA严严严严格格格格配配配配对对对对，，，，并并并并且且且且3`3`末端为末端为末端为末端为GG、、、、C C或或或或T T时引发效率较高时引发效率较高时引发效率较高时引发效率较高。
⑥⑥⑥⑥引引引引物物物物5`5`末末末末端端端端碱碱碱碱基基基基可可可可不不不不与与与与模模模模板板板板DNADNA匹匹匹匹配配配配，，，，可可可可添添添添加加加加与与与与模模模模板板板板无无无无关关关关的的的的序序序序列列列列( (如如如如限限限限制制制制性性性性核核核核酸酸酸酸内内内内切切切切酶酶酶酶的的的的识识识识别别别别序序序序列列列列、、、、ATGATG起起起起始始始始密密密密码码码码子子子子或或或或启启启启动动动动子子子子序序序序列列列列等等等等) )，，，，便便便便于于于于克克克克隆隆隆隆和和和和表表表表达，但其保护碱基有一定的要求达，但其保护碱基有一定的要求达，但其保护碱基有一定的要求达，但其保护碱基有一定的要求⑦⑦⑦⑦引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性 六、PCR中应注意的事项（一）防止污染（一）防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EPEP管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作（（二）设立对照二）设立对照：：阳性对照：阳性对照： 阳性模板阳性模板阴性对照：阴性对照： 阴性模板阴性模板试剂对照：试剂对照： 除模板外的所有组分除模板外的所有组分 第二节 PCR技术应用 一、PCR技术的主要类型㈠反向㈠反向PCR PCR ㈥锚定㈥锚定PCRPCR㈡㈡不对称不对称PCR PCR ㈦㈦原位原位PCRPCR㈢㈢RT-PCR RT-PCR ㈧重组 ㈧重组PCRPCR㈣㈣差异显示差异显示PCRPCR ㈨免疫 ㈨免疫PCRPCR㈤㈤实时定量实时定量PCRPCR ㈩多重 ㈩多重PCRPCR 1)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列 已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶 2）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA 方法：采用两种不同浓度的引物分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 高浓度引物低浓度引物 3 3））RTRT－－PCR:PCR:是以反转录的是以反转录的cDNAcDNA作模板所进行作模板所进行的的PCRPCR反应反应, ,用于测定基因表达的强度和鉴定用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变已转录序列是否发生突变, ,呈现呈现mRNAmRNA多态性多态性, ,克隆克隆mRNAmRNA的的5 5’’和和3 3’’末端序列末端序列, ,以及从非常少以及从非常少量的量的mRNAmRNA样品构建大容量的样品构建大容量的cDNAcDNA文库。
文库 逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增 基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链 4 4）多重）多重PCRPCR：：在一个反应体系中使用一对以上引物的在一个反应体系中使用一对以上引物的PCRPCR称为多重称为多重PCRPCR其结果是产生多个其结果是产生多个PCRPCR产物，用于检产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失测特定基因序列的存在或缺失电电电电泳泳泳泳引物引物 5 5）实时定量）实时定量PCRPCR技术原理技术原理实时定量实时定量PCRPCR（也称（也称TaqManTaqMan PCR, PCR,以下简称以下简称FQ-PCRFQ-PCR）是美国）是美国PEPE（（PerkinPerkin Elmer Elmer）公司）公司19951995年研制出来的一种新的核酸定量技术，年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规该技术是在常规PCRPCR基础上加入荧光标记探针基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通来实现其定量功能的，与变通PCRPCR相比，相比，FQ-FQ-PCRPCR具有许多优点具有许多优点 实时定量实时定量PCR(realPCR(real-time PCR):-time PCR):通过特定设计的通过特定设计的PCRPCR仪器来实时检测仪器来实时检测PCRPCR扩增扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量实时定量PCRPCR。
实时荧光定量实时荧光定量PCR:PCR:实时定量实时定量PCRPCR在检测过程中通过检测标记的荧在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个光信号的累积来实时监测整个PCRPCR进程，最后进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，故通过标准曲线对未知模板进行定量分析，故称为实时荧光定量称为实时荧光定量PCRPCR 原理和方法FQ-PCRFQ-PCR的工作原理是的工作原理是利用利用TaqTaq酶的酶的5’→3’5’→3’外切酶活性，在外切酶活性，在PCRPCR反反应系统中加入一个荧光标记探针应系统中加入一个荧光标记探针该探针可与引物包含序列内的该探针可与引物包含序列内的DNADNA模板发生特异性杂交，模板发生特异性杂交，探针的探针的5’5’端标以荧光发射基因端标以荧光发射基因FAMFAM（荧光发（荧光发射峰值在射峰值在518nm518nm处），处），靠近靠近3’3’端标以荧光淬灭基团端标以荧光淬灭基团TAMRATAMRA（荧光发射（荧光发射峰值在峰值在582nm582nm处），探针的处），探针的3’3’端被磷酸化以防止探针在端被磷酸化以防止探针在PCRPCR扩增过程中被延伸。
当扩增过程中被延伸当探针保持完整时，探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射淬灭基团抑制发射基团的荧光发射发射基团一发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm518nm处的光密度增加而被荧光探测系处的光密度增加而被荧光探测系统检测到复性期探针与模板统检测到复性期探针与模板DNADNA发生杂交，延伸期发生杂交，延伸期TaqTaq酶酶随引物延伸沿随引物延伸沿DNADNA模板模板移动，移动，当移动到探针切断当移动到探针切断, ,淬灭作用被解除淬灭作用被解除，荧光信号释放出来，荧光信号释放出来. .模模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放由于板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放由于被释放被释放的荧光基团数目和的荧光基团数目和PCRPCR产物数量是一对一的关系产物数量是一对一的关系, ,因此用该技术因此用该技术可对模板进行准确定量可对模板进行准确定量 实时实时PCRPCR技术原理技术原理 实验仪器一般使用实验仪器一般使用PEPE公司研制的公司研制的ABI7100ABI7100型型 PCRPCR扩增仪，也可用其它扩增仪，也可用其它PCRPCR仪。
如果用仪如果用ABI7700ABI7700型反应型反应系统进行实验，反应结型反应型反应系统进行实验，反应结束后束后, ,通过电脑分析通过电脑分析, ,可直接给出定量结果如可直接给出定量结果如果用其他果用其他PCRPCR仪仪, ,则需要同时使用荧光探测仪测则需要同时使用荧光探测仪测量反应管中的荧光信号量反应管中的荧光信号, ,计算出计算出RQ+RQ+、、RQ-RQ-、、△△RQRQRQ+RQ+代表样品管荧光发射基团发光强度代表样品管荧光发射基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率与淬灭基团发光强度的比率,RQ-,RQ-代表空白管中代表空白管中二者的比率二者的比率,△RQ,△RQ（（△△RQ=RQ+-RQ-RQ=RQ+-RQ-）代表）代表PCRPCR过过程中荧光信号变化量，经过数据处理，即可得程中荧光信号变化量，经过数据处理，即可得出定量结果出定量结果 由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性探由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性探针设计一般应符合以下条件：针设计一般应符合以下条件：①①探针长度应在探针长度应在2020～～4040个碱基左右，保证结合特异性个碱基左右，保证结合特异性。
②②GCGC碱基含量在碱基含量在40%40%～～60%60%，避免单核苷酸序列的重复避免单核苷酸序列的重复③③避免与引物发生杂交或重叠避免与引物发生杂交或重叠④④探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳探针与模板结合稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的定程度，因此探针的TmTm值要比引物的值要比引物的TmTm值至少高出值至少高出5℃5℃另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响引物的距离都对实验结果有影响 特特 点点 FQ-PCRFQ-PCR不仅具有普通不仅具有普通PCRPCR的的高灵敏性高灵敏性，而且由于荧，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCRPCR扩增扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNADNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克，克服了常规服了常规PCRPCR的许多缺点。
的许多缺点FQ-PCRFQ-PCR只须在加样时打开一次只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCRPCR后处理，后处理，避免了常规避免了常规PCRPCR操作中的诸多弊端操作中的诸多弊端 1 病原体测定由于由于PCRPCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行但技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性只要由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性只要有微量病原体存在，有微量病原体存在，PCRPCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此模板依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此模板定量显得特别重要常规定量显得特别重要常规PCRPCR由于不能定量而限制了其应用，然而，由于不能定量而限制了其应用，然而，PEPE公司研制的公司研制的FQ-PCRFQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能目前该技技术给解决这一问题提供了可能目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。
肠杆菌等许多病原体的检测研究 MorrisMorris等用等用FQ-PCRFQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（者血清中丙肝病毒（HCVHCV）进行了研究进行了研究FQ-PCRFQ-PCR技术在保持巢式技术在保持巢式PCRPCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCVHCV的的有效方法同时，由于有效方法同时，由于FQ-PCRFQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据给药物治疗及疗效观察提供参考依据 以前常规检测大肠杆菌的方法，都因为繁琐，需要大以前常规检测大肠杆菌的方法，都因为繁琐，需要大量的量的PCRPCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制美国后处理过程及不能对标本定量而受到限制美国WithamWitham等等19961996年将年将FQ-PCRFQ-PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究针对不同血清变异型的大肠贺氏毒素基因的检测研究。
针对不同血清变异型的大肠杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异性他们同时还对探针相对于引物的位置、反应液中探性他们同时还对探针相对于引物的位置、反应液中探针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验，针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验，以提高实验的准确性和精确性由于以提高实验的准确性和精确性由于TaqManTaqMan系统可以一系统可以一次测量次测量9696管样品，还可对模板进行准确定量，又不需要管样品，还可对模板进行准确定量，又不需要进行电泳及进行电泳及EBEB染色后处理过程，实际应用方便，从而提染色后处理过程，实际应用方便，从而提高了实验的参考价值和应用价值因此该实验方法是食高了实验的参考价值和应用价值因此该实验方法是食品检测方面的一个突破品检测方面的一个突破 2. 肿瘤研究 意大利意大利GelminiGelmini等用等用FQ-PCRFQ-PCR技术检测乳腺癌标本技术检测乳腺癌标本c-erbB-2c-erbB-2基因拷贝基因拷贝数目变异情况。
他们以数目变异情况他们以β-β-肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，肌动蛋白基因为参照探索最佳实验条件，当扩增循环数在当扩增循环数在2828～～3131之间时，之间时，△△RQRQ与模板与模板DNADNA有着较好的剂量依有着较好的剂量依赖关系他们在此条件下扩增了赖关系他们在此条件下扩增了c-erbB-2c-erbB-2基因和基因和β-β-球蛋白基因，球蛋白基因，发现发现△△RQRQ都与各自的模板都与各自的模板DNADNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的不同，但是各个实验浓度下二者的△△RQRQ之比却是恒定的说明尽之比却是恒定的说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果他们将实验数据与管二者发光效率不同，却不影响定量效果他们将实验数据与SouthernSouthern印迹结果和已报告的竞争性印迹结果和已报告的竞争性PCRPCR结果比较都显示高度相关结果比较都显示高度相关性（性（n=25n=25，，r=0.94r=0.94，，P P〈〈0.010.01） 3. 基因表达研究 由于由于TaqManTaqMan系统及荧光探针的应用，对系统及荧光探针的应用，对mRNAmRNA的检测显得较以前常的检测显得较以前常用的方法如用的方法如NorthernNorthern印迹、印迹、RT-PCRRT-PCR定量法要方便、快速、准确得定量法要方便、快速、准确得多。
为了探测骨髓基质血小板生成因子（多为了探测骨髓基质血小板生成因子（TPOTPO）在巨核细胞生成过）在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢（（ITPITP）、再生障碍性贫血（）、再生障碍性贫血（AAAA）和特发性血小板多症（）和特发性血小板多症（ETET）等疾）等疾病过程中的病理生理意义，日本病过程中的病理生理意义，日本HirayamaHirayama等用等用TaqManTaqMan EZ RT-PCR EZ RT-PCR试剂盒在试剂盒在ABI7700ABI7700反应系统测定了正常人和反应系统测定了正常人和ITPITP、、AAAA、、ETET病人的骨病人的骨髓基质细胞髓基质细胞TPO mRNATPO mRNA水平，又用水平，又用ELISAELISA方法测定了骨髓和末梢血的方法测定了骨髓和末梢血的TPOTPO浓度结果显示浓度结果显示ITPITP和和AAAA病人病人TPO mRNATPO mRNA水平明显升高，而水平明显升高，而ETET病病人的人的TPO mRNATPO mRNA水平则正常，经类固醇治疗后水平则正常，经类固醇治疗后ITPITP病人病人TPO mRNATPO mRNA水平水平下降；骨髓下降；骨髓TPOTPO的浓度与其的浓度与其 mRNAmRNA水平有相关性；在正常人和水平有相关性；在正常人和ITPITP病病人，人，TPO mRNATPO mRNA表达水平与巨核细胞计数也有相关性。
这个实验对表达水平与巨核细胞计数也有相关性这个实验对阐明阐明TPO TPO 的作用提供了依据的作用提供了依据 4. 免疫组份分析 对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行1997年Lang等用FQ-PCR技术进行实验，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-β成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据 5. 基因突变及多态性的研究 美国美国IbrahimIbrahim等等19971997年用年用FQ-PCRFQ-PCR技术对正常痘病毒多态性技术对正常痘病毒多态性进行了研究他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因进行了研究他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一的某一DNADNA片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。
该技术也可此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定该技术也可用于猴痘和病毒用于猴痘和病毒DNADNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究疫苗的单核苷酸变异多态的研究 6. 其他方面 日本日本IsonoIsono利用利用FQ-PCRFQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究他们以核基因拷贝数关系的研究他们以核基因CabCab作为内参照，进行作为内参照，进行叶绿体基因叶绿体基因rbc1rbc1拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来19981998年美年美国国HigginsHiggins等还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原等还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因（激活基因（plapla）的实验方法的实验方法 综上所述，综上所述，FQ-PCRFQ-PCR作为一种核酸定量技术，应用作为一种核酸定量技术，应用较多且较成熟的主要是在病原体检测方面，其优较多且较成熟的主要是在病原体检测方面，其优越性在此方面也得以充分体现。
因此将该项技术越性在此方面也得以充分体现因此将该项技术进一步开发应用于临床，具有很大潜力但是在进一步开发应用于临床，具有很大潜力但是在遗传病和肿瘤研究方面，尤其是基因表达的研究，遗传病和肿瘤研究方面，尤其是基因表达的研究，该技术目前应用的还较少，在此方面加强研究应该技术目前应用的还较少，在此方面加强研究应用，将会有广阔的前景用，将会有广阔的前景 二、PCR技术应用•研究–基因克隆，DNA测序，分析突变•诊断–细菌、病毒、寄生虫检测，诊断•人类基因组工程–遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱•法医–犯罪现场标本分析•肿瘤–各种肿瘤检测•其他…… PCR示例示例一、实验目的一、实验目的学习学习PCRPCR分析的原理与技术分析的原理与技术 1 1、材料：含、材料：含1Kb1Kb插入片段的克隆载体插入片段的克隆载体Pmd18-TPmd18-T 质粒质粒DNADNA2 2、、仪器：微量移液器及吸头、仪器：微量移液器及吸头、PCRPCR仪及仪及PCRPCR管管 琼脂糖凝胶电泳设备琼脂糖凝胶电泳设备3 3、试剂：、试剂：1010X XPCRPCR 反应缓冲液反应缓冲液 25mmol/L MgCl25mmol/L MgCl2 2 10mmol/L 10mmol/L dNTPdNTP 10 10μμmol/L mol/L 引物引物1 1和引物和引物2 2二、实验材料、仪器和二、实验材料、仪器和试剂试剂 1.1.按照如下体积向按照如下体积向PCRPCR管中按顺序加入各试剂管中按顺序加入各试剂 并混匀并混匀：： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/L 引物1 1.0 μL 10μmol/L引物2 1.0μL 质粒DNA 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 水补充至 25.0 μL三、操作步骤三、操作步骤 2.2.按照如下体积向按照如下体积向PCRPCR管中按顺序加入各试剂管中按顺序加入各试剂 并混匀：并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/L 引物1 1.0 μL 10μmol/L引物2 1.0μL 质粒DNA 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 水补充至 25.0 μL三、操作步骤三、操作步骤 3.3.反应完成后反应完成后, ,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀匀, ,上样电泳。
上样电泳三、操作步骤三、操作步骤琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 。