1ABCA1 基因多态性与血浆载脂蛋白 A1 水平的关系作者：李亚，王玉明，王丹，贺勇 【摘要 】 目的：探讨汉族人群腺苷三磷酸结合盒转运体A1（ABCA1）基因单核苷酸多态性（ SNP）与血浆载脂蛋白A1（apoA1 ）水平的关系. 方法：选取 ABCA1 基因 R219K, V825I, M883I 和 R1587K 等 4 个编码区 SNPs，采用 PCR 限制性片断长度多态性分析技术确定 376 名健康个体基因型；用 THESIAS 程序分析 SNPs 的连锁不平衡关系及单倍型. 结果：受检人群中，4 种SNPs 各自不同基因型个体间 apoA1 水平差异均未见统计学意义（P ＞ 0.05）. R219K 与 M883I, V825I 与 M883I 以及 V825I 与R1587K 两两间存在连锁不平衡(P<0.01). 以 V825I 和 R1587K 构建的两位点单倍型中，IK 单倍型携带者 apoA1 水平较 VR 单倍型携带者显著降低(P<0.05). 结论：ABCA1 基因 V825I 和 R1587K多态性与汉族人群血浆 apoA1 水平变化有关，但这种关联取决于该两个 SNPs 间形成的单倍型. 【关键词】 ABCA1 基因；载脂蛋白 A1；单倍体型；连锁不平衡20 引言血浆高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL C ）水平降低是冠心病的独立危险因素之一［1］. 腺苷三磷酸结合盒转运体 A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）介导胆固醇、磷脂从肝外组织的流出，并通过与载脂蛋白 A1（apolipoprotein A1，apoA1）相互作用，在胆固醇逆向转运和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）生成的起始阶段发挥着关键的作用，因此，ABCA1 被认为是决定 HDL C 水平的主要因素之一［2 ］. 群体遗传学研究表明，ABCA1 基因的某些单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP ）可改变 ABCA1 蛋白活性并由此引起 HDL C 水平变化，从而影响个体对冠心病的易感性［ 3-4］. 然而，有关 ABCA1 基因 SNPs 对血浆 apoA1 水平影响的研究报道却相对缺乏.为此我们在本研究中探讨了 ABCA1 基因 4 种 SNPs 及其构成的单倍型与汉族人群 apoA1 水平变化的关系.1 对象和方法1.1 对象来自四川大学华西医院和成都医学院第一附属医院无血缘关系的四川地区汉族体检个体 376（男 194，女 182）例，年龄(58.4±8.6)岁，apoA1 水平（1.324±0.186） g/L，体质量指数3（24.62±3.39） kg/m2，总吸烟率为 27%，并经询问病史、体检、心电图等检查排除心血管疾病史.1.2 方法1.2.1 标本采集与处理禁食 12 h 后抽取研究对象外周血 5 mL，采用免疫比浊法并按试剂盒（上海荣盛生物技术公司）推荐条件测定血浆 apoA1 水平；另采集外周血 3 mL，1 mL ACD 抗凝，盐析法提取 DNA，TE 缓冲液溶解 DNA 并置于 4 ℃冰箱中备用.1.2.2 多态位点的基因型分型采用 PCR 限制性片断长度多态性分析法对 4 个 SNPs 进行分型. 首先，参照基因组序列（GenBank登录号：NM 005502 ）设计合成相应 PCR 引物，对受检者ABCA1 基因 R219K， V825I，M883I 和 R1587K 等 4 个 SNPs 位点所包含的 DNA 序列进行扩增；再取扩增产物 15 μL，分别加入 4 U 限制性内切酶和 2 μL 酶切缓冲液，并加超纯水至总体积 20 μL，37℃水浴中保温 16 h；最后，消化产物经 30 g/L 琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统分析电泳结果，判定个体基因型. PCR 反应条件、限制性内切酶以及各基因型酶切情况见表 1.表 1ABCA1 基因 SNPs 的基因型分型统计学处理：每个 SNP 的 Hardy Weinberg 平衡检验用 χ2 检4验，在 HWE 软件上进行. 单个 SNP 位点基因型与 apoA1 水平的关系分析采用协方差分析（用 SPSS10.0 软件）. SNPs 间配对连锁不平衡估算以及各种单倍型与 apoA1 水平的关联分析均使用THESIAS 程序进行. apoA1 水平用 x±s 表示；除连锁不平衡检验用α=0.001 为检验水准外，其余统计学分析均以 P≤0.05 为差异有统计学意义.2 结果2.1 等位基因和基因型的频率分布经 χ2 检验，4 种 SNPs 各基因型频率在本研究人群中分布符合 Hardy Weinberg 平衡（P ＞ 0.05） ，表明本研究样本具有群体代表性. 其中，变异型等位基因 K219 和 I825 的频率高于欧美人群（0.452 vs 0.27, 0.323 vs 0.056，P ＜0.01） ；而 I883 等位基因在欧美人群则为野生型等位基因［5］ （表 2）. 表 24 种多态位点等位基因和基因型频率2.24 种 SNPs 不同基因型与 apoA1 水平的关系分析为准确地反映不同基因型对血浆 apoA1 水平的影响，我们采用了协方差分析，以排除各种混杂因素对研究结果的影响. 校正协变量（年龄、吸烟和体质量指数）后的结果显示，R219K, V825I, M883I 和 R1587K多态各自不同基因型个体间 apoA1 水平差异均无统计学意义（P ＞ 0.05, 表 3）. 表 34 种多态位点不同基因型个体间 apoA1 水5平比较2.3 配对连锁不平衡分析 ABCA1 基因 4 个 SNPs 位点的配对连锁不平衡用统计量 D′表示（D′=D/Dmax）. 表 4 可见，在全部 6个配对组合中，V825I 分别与 M883I 和 R1587K 间存在较强的连锁不平衡（D′>0.7）. 此外，在 R219K 和 M883I 间也检测到有统计学意义的连锁不平衡（D′=0.572 ）. 值得注意的是，在 R219K至 R1587K 位点约 1.36 kb 范围内，我们未发现 2 个以上的 SNPs位点彼此间的连锁不平衡关系.2.4ABCA1 基因单倍型与 apoA1 水平的关联分析由于在分析区域内未检测到 3 或 4 个 SNPs 位点彼此间的连锁不平衡，我们仅以具有连锁不平衡关系的 SNPs 构建两位点单倍型，分析这些单倍型与 apoA1 水平变化的关系 . 表 5 显示，以 V825I 和 R1587K 构建的单倍型中，IK 单倍型携带者其 apoA1 水平较 VR 单倍型携带者明显降低［-0.177（-0.269～-0.09） ，P=0.036］.表 4ABCA1 基因SNPs 间配对连锁不平衡系数和统计学意义表 5 各种单倍型与apoA1 水平的关联分析3 讨论ApoA1 是 HDL 主要的载脂蛋白，占其整个结构蛋白的 70%. 正如 HDL 水平与冠心病发生呈高度负相关［1］ ，个体 apoA1 水平降6低，患冠心病风险也将随之增大. 因此，对 apoA1 代谢调控因素的研究也是冠心病病因学的重要内容. 研究发现，作为一种跨膜转运蛋白，ABCA1 在促进胆固醇的细胞流出过程中需借助与 apoA1 间的相互作用，将先转运出的磷脂结合到 apoA1 上，形成磷脂apoA1 复合物；然后再以该复合物为受体，接受从细胞中流出的胆固醇，进而形成新生的 HDL；若转运至胞外的胆固醇量不足，导致磷脂 apoA1 复合物不能充分与之结合，则多余的 apoA1 将在肾脏中很快被清除［6］ ，提示 ABCA1 活性与血浆 apoA1 水平可能存在一定的相关性.本研究结果表明，汉族人群 ABCA1 基因 SNPs 与 apoA1 水平变化的关系明显不同于欧美人群. 本研究中 4 种 SNPs 各自不同基因型个体间 apoA1 水平均未见显著性差异，提示汉族人群 apoA1水平不与 ABCA1 基因上述单个 SNP 位点直接关联.此外，这种差异还反映在受检 DNA 区域单倍型组成及其与apoA1 水平的关系上 . 欧美人群中，ABCA1 基因 R219K 至 M883I间各 SNP 两两间处于强连锁不平衡状态（D′ ＞0.9） ，呈现出典型的单倍型模块（haplotype block）结构；而与之相距较远的 R1587K则平衡传递［5］. 然而，本研究人群中对应的各 SNP 位点间不仅连锁不平衡强度低于欧美人群，也未检测到 2 个以上位点彼此间的连锁不平衡. 我们基于连锁不平衡关系构建了两位点单倍型, 结果发7现，在 V825I 和 R1587K 构建的单倍型中， IK 单倍型携带者apoA1 水平较 VR 单倍型携带者明显降低，提示由 V825I 和R1587K 构成的单倍型与汉族人群 apoA1 水平变化具有相关性.本研究结果与文献［5 ］报道有较大差异. 我们认为，可能有以下 3 方面原因：首先，本文的资料来自汉族一般人群， 而Tregouet 等的研究对象则是冠心病患者， 二者脂蛋白代谢过程应该有所不同； 其次， 种族间的遗传背景差异也可能使相同的变异产生不同的表型效应； 另外， apoA1 水平作为一种受多种因素影响的表型性状， 还可能与不同人群所处的生活环境有关.【参考文献】［ 1］ Abbott RD, Wilson PW, Kannel WB, et al. High density lipoprotein cholesterol, total cholesterol screening, and myocardial infarction：The Framingham Study［J］. Arteriosclerosis,1988, 8（3 ）: 207-211.［2］ Jonathan C, Cohen, Robert S, et al. Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol［J］. Science, 2004, 305（6）: 869-872.［3］ Brunham LR, Singaraja RR, Hayden MR, et al. 8Variations on a gene: Rare and common variations in ABCA1 and their impact on HDL cholesterol and atherosclerosis ［J］. Annu Rev Natr, 2006, 26:105-129.［4］ Singaraja RR, Liam R, Kastelein JP,et al. Efflux and atherosclerosis: The clinical and biochemical impact of variations in the ABCA1 gene［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003, 23（8 ）: 1322-1332.［5］ Tregouet DA, Richard S, Nicaud V, et al. In depth haplotype analysis of ABCA1 gene polymorphisms in relation to plasma apo1 levels and myocardial infarction［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004, 24（4 ）:775-781.［6］ Attie AD, Kastelein JP, Hayde。