ELISA 操作流程 （一） 、基本操作流程 方法一 双抗体夹心法（用于检测未知抗原的） 1 包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为 0.5~20μg／ml,按 100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜 2. 洗板： 次日弃去孔内液体， 在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体， 加入洗涤液 （约 280—300ul/孔)，漂洗 2-3 次，每次 3—5min; 3. 封闭：按 200-250ul/孔加入封闭液，室温 2-3 小时或 37℃1—2 小时,也可 4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液； 4 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品（含未知抗原)稀释至所需浓度； 5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤） ； 6 加样:按排列顺序依次加入 50—100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或 37℃孵育 30-60min； 7 洗板：同步骤 2； 8. 加酶标抗体:酶标抗体的稀释按产品说明书， 按 50—100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或 37℃孵育 1 小时； 9. 洗板：同步骤 2; 10. 加底物液显色：按 100—150ul/孔加入新配制的 TMB 底物溶液，室温避光反应 15～30 分钟。
11. 终止反应：于各反应孔中加入 50ul 的终止液 12 结果判定：可于白色背景上，直接用裸眼观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅，以“+” 、 “-”号表示.也可在酶标仪上于 450nm（若以 ABTS 显色，则 410nm）处测 OD 值检测时以空白对照孔调零后测各孔 OD值，若样品孔中的 OD 值大于阴性对照孔的 21 倍,即为阳性 方法二 间接法（用于检测未知抗体) 1 包被：用包被缓冲液将已知抗原稀释至 05～20μg／ml,按 100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜，次日洗涤 2—3 次; 2 洗板：次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔） ，漂洗 2—3 次，每次 3—5min; 3 封闭：按 200-250ul/孔加入封闭液，室温 2-3 小时或 37℃1-2 小时,也可 4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液； 4. 样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度； 5. 标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度(定性分析可省略本步骤） ； 6。
加样：按排列顺序依次加入 50—100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体)，阴性对照及阳性对照，室温或 37℃孵育 30-60min； 7 洗板：同步骤 2; 8 加酶标抗体：按 50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体(抗抗体)，室温或 37℃孵育 1 小时；酶标抗体的稀释按产品说明书； 9 洗板：同步骤 2； 10. 加底物液显色：按 100-150ul/孔加入新配制的 TMB 底物溶液，室温避光反应 15～30 分钟. 11 终止反应：于各反应孔中加入 50ul 的终止液 12. 结果判定:裸眼观察结果或用酶标仪测 OD 值,有色产物的生成量＝抗体量 （二） 、ELISA 常用的四种方法 1．直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面； 加酶标抗体，形成抗原-抗体复合物； 加入底物； 结果判定：有色产物的生成量＝抗原量 2．间接法测定抗体 将抗原吸附于固相载体表面； 加待检抗体， 形成抗原-抗体复合物； 加酶标抗体（抗抗体） ； 加入底物； 结果判定：有色产物的生成量＝抗体量。
3．双抗体夹心法测定抗原 将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面; 加抗原,形成抗原—抗体复合物; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物； 加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体); 加入底物； 结果判定：有色产物的生成量＝抗原量 4. 竞争法测定抗原 将抗体吸附在固相载体表面； 加入酶标抗原和待测抗原； 加入底物； 结果判定：对照孔与样品孔有色产物的生成量的差与未知抗原的量成负相关。