毛霉型腐乳发酵菌株筛选和人工接种发酵腐乳感官品质评价 苏彬,任璐,张玉,宋佳佳,王晨,王洪伟*,索化夷*1(西南大学 食品科学学院,重庆,400715)2(川渝共建特色食品重庆市重点实验室,重庆,400715)腐乳在中国有着悠久的历史,早在魏朝(公元386—534年)就有了对腐乳制作的记录[1]传统腐乳以自然发酵的方式进行生产,主要包括制作豆腐、压块、切割、自然接种、前发酵、加辅料、后发酵等过程[2]传统发酵制曲过程参与多种微生物,腐乳风味浓郁,但同时由于涉及到大量的环境微生物,导致产品的品质和安全性不可控[3]由于人工接种发酵安全性更高[4],品质更好控制,近年来已应用于酸笋[5]、泡菜[4]、水豆豉[6]等发酵产品但是人工接种发酵食品的风味不及传统发酵食品,为腐乳的工业化生产带来了难题腐乳感官评价体系构建和优良发酵菌株的筛选是关键解决途径毛霉型腐乳发酵过程涉及多种微生物,其主要制曲菌种为雅致放射毛霉细菌群落主要为不动杆菌(Acinetobacte)、肠球菌(Enterococcus)和链球菌(Streptococcus)对于真菌群落,腐乳毛坯以丝孢酵母(Trichosporon)和放射菌(Radiomycetes)为主,腌坯过程曲霉(Aspergillus)和丝孢酵母占主要优势[7]。
雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)能分泌多种酶,将大豆中的蛋白质、脂质和碳水化合物水解成氨基酸和小分子,对品质形成有重要贡献,是主要的腐乳发酵菌种[8]目前,根据蛋白酶活力等指标,已筛选出雅致放射毛霉 MGC317[9]、雅致放射毛霉WL3.006[10]作为腐乳的发酵菌株,但是与传统发酵腐乳相比,这些腐乳的品质如何研究较少腐乳应具有润滑细腻的口感、咸鲜的滋味和浓厚的香气[11]氨基酸是一类具有味感的物质,可经代谢转化后变成挥发性风味成分,游离氨基酸含量对腐乳的滋味有着重要影响[12]顶空固相微萃取(head space solid-phase micro-extraction,HS-SPME)结合GC-MS进行分析被广泛用于检测腐乳中的挥发性化合物[8]但仅用仪器分析,则无法预测人类感知到的整体风味,感官评价作为一种可靠的方法,被用来表征腐乳的风味特征[13]偏最小二乘回归(partial least-squares regression,PLSR)是将自变量和因变量分别进行线性组合分析,再将求得的数据进行关联分析的统计学方法,在筛选关键风味物质上具有广泛的应用目前结合感官评价与仪器分析,PLSR阐明了4-甲氧基苯酚、苯酚、愈创木酚等酚类化合物是腊肉产生烟熏风味的关键物质[14]。
PLSR剖析了正丁醇、苯乙酸乙酯、戊酸、己酸、己酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯是白酒的关键风味物质[15]将仪器分析和感官定量描述分析相结合使我们可以更好地比较产品风味品质本研究根据菌株生长量、蛋白酶和脂肪酶活力,筛选出具有良好发酵性能的雅致放射毛霉CJ-6其次将人工接种CJ-6发酵的腐乳与传统发酵腐乳的感官特征和挥发性物质进行比较,确定人工接种发酵腐乳与传统发酵腐乳具有相似的风味特征然后利用GC-MS检测腐乳中的挥发性物质并结合香气活性值(odor activity value,OAV)和PLSR探讨雅致放射毛霉CJ-6对腐乳风味特征的影响及其机制最后探究人工接种CJ-6腐乳发酵过程中硬度、弹性和游离氨基酸含量的变化,评估其口感和滋味旨在为现代腐乳工业中发酵菌株的选择、生产工艺和风味的改进提供新方向1 材料与方法1.1 材料与试剂菌株:所用菌株皆为雅致放射毛霉,其中RY-1、RY-2和RY-3购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC),菌株编号分别为CICC 40701、CICC 41043、CICC 41355。
CY-4、CY-5和CJ-6是从市售腐乳中分离所得并且CJ-6中不存在与真菌毒素合成相关的PKS 及 PKS-NRPS 混合代谢合成的相关基因及代谢途径4种传统发酵腐乳S1、S2、S3、S4,市售;S5为人工接种CJ-6发酵腐乳试剂:邻二氯苯标准品、福林酚,北京索莱宝生物科技有限公司1.2 仪器与设备SW-CJ-2F超净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;GCMS-QP2010气相色谱质谱联用仪,日本岛津公司;DB5-MS气相毛细管柱,美国Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头,美国Supelco公司;CT-3质构仪,美国Brookfield公司;L-8900011001全自动氨基酸分析仪,日本日立公司1.3 实验方法1.3.1 菌株生长量的测定参考陈菽等[16]的方法,略作修改取2 mL 5×106个/mL孢子悬浮液加入250 mL 锥形瓶中,180 r/min振荡培养,每隔12 h取发酵液,用已知重量的滤纸过滤,水洗2次后一起于105 ℃的烘箱烘至恒重,称重,计算可得菌株生长量1.3.2 菌株酶活力的测定粗酶液的制备:准备5 g样品,加入15 mL缓冲液,高速匀浆机打碎后置于40 ℃水浴锅中60 min,定容至100 mL,纱布过滤后滤液4 000 r/min离心10 min,上清液为待测酶液。
福林酚法[17]测定蛋白酶活力,将40 ℃下,1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位(U/g)PVA-橄榄油乳化液水解滴定法[17]测定脂肪酶活力,在40 ℃下,1 min水解底物产生1 μmol脂肪酸定义为1个脂肪酶活力单位(U/g)1.3.3 腐乳的制作参考CHOU等[18]的方法,略作修改豆腐切成2.5 cm×2 cm×2.5 cm大小,按10%(体积分数)的接种量接种雅致放射毛霉CJ-6孢子悬浮液(5×106个/mL),进行前发酵;搓毛后,加入10%(质量分数,下同)食盐,在25 ℃下腌制2 d;然后加入10%的盐水没过样品,在同样的条件下腌制3 d;再用10%的盐水冲洗腌制好的豆腐2～3次,沥干水分;装罐,加入辅料[10%的盐和12%(体积分数)的白酒],封罐,25 ℃发酵1.3.4 感官评价参考周柬等[19]的方法进行感官评价,略作修改感官评价小组经过120 h感官培训,参加过豆豉[19]、腊肉[14]、酸奶[20]等感官评价实验参考CHEN等[13]的方法确定感官描述词,将腐乳感官描述词、参比样及3位随机数字编码的腐乳样品呈递给感官评价人员感官评价人员以15点尺度对样品进行评价,增量为0.5,其中0表示“无”,15表示“极高”。
试验数据使用云智能感官评价系统收集1.3.5 挥发性物质测定[11]样品准备:称取腐乳样品3 g加入20 mL顶空进样瓶中,添加3 μL 内标(100 μg/mL的邻二氯苯溶液)用聚四氟乙烯隔垫密封60 ℃下保温平衡10 min后,插入DVB/CAR/PDMS萃取头, 完全伸出萃取头距液面上方0.5 cm处,在60 ℃下萃取40 min,萃取结束后在GC 进样口(250 ℃)解析5 min色谱条件:DB5-MS毛细管柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm);进样口温度为250 ℃;载气为高纯氦气(≥99.999%);载气流速为1.0 mL/min;不分流方式进样;40 ℃保持5 min后以4 ℃/min升至130 ℃,保持1 min后以10 ℃/min升至220 ℃并保持5 min质谱条件:离子源230 ℃,接口250 ℃,电离方式为电子电离(EI)源;电子能量70 eV;质量扫描范围30～500m/z根据NIST14数据库检索对化合物进行定性分析,根据内标法对化合物进行半定量分析的方法含量按公式(1)计算:(1)式中:Ci,未知化合物含量,ng/g;Si,未知化合物峰面积;S,内标物峰面积;ρ,内标物浓度,μg/mL;V,内标物体积,μL;m,样品质量,g。
1.3.6 OAV的计算OAV按公式(2)计算:(2)式中:Ci,化合物的含量,ng/g;OTi,查询所得的化合物的香气阈值,ng/g1.3.7 质构特性测定质构特性的测定参考蒋丽婷等[21]的方法,略作修改取白坯、毛坯、盐坯、发酵10 d、发酵20 d、发酵40 d和成品(发酵60 d)样品,采用质地剖面分析(texture profile analysis,TPA)模式,利用质构仪检测探头二次下压测定硬度和弹性测定参数:探头型号TA4/1000,测前探头下压速度1.5 mm/s,测试速度1.0 mm/s,测厚探头回程速度1.5 mm/s,压缩比例30%,触发力2 g1.3.8 游离氨基酸测定参考索化夷等[22]的方法测定准确取白坯、毛坯、盐坯、发酵10 d、发酵20 d、发酵40 d和成品(发酵60 d)的样品100 mg,加入9 mL 4 g/100 mL磺基水杨酸溶液振荡摇匀,于4 ℃冰箱静置 24 h,16 000 r/min 离心5 min上清液过膜(0.45 μm),用全自动氨基酸分析仪测定1.3.9 数据分析使用Origin 2018软件绘制雷达图,使用XLSTAT 2019.2.2进行主成分分析(principal component analysis,PCA)、层次聚类分析法(agglomerative hierarchical clustering, AHC)、PSLR分析。
2 结果与分析2.1 六株菌发酵性能比较2.1.1 菌株生长量在工业生产中,使用生长能力强的菌株作为发酵剂可以缩短发酵周期、提高效率菌株生长量如图1-a所示CJ-6和RY-1在0～36 h生长速度高于其他4株毛霉,且在36 h达到最大生长量,分别为(0.455±0.040)、(0.416±0.043) g,CJ-6生长速度最快a-菌株生长量;b-菌株蛋白酶活力;c-菌株脂肪酶活力2.1.2 菌株蛋白酶活力在腐乳发酵过程中,大豆中蛋白质的水解程度对腐乳风味、口感和质地有着重要影响[9]菌株蛋白酶活力如图1-b所示酶合成在0～48 h迅速增加,在达到最大活性后逐渐减少在CJ-6中观察到蛋白酶活力增长最快且有最高的酶活力(310.564±5.383)U/g童佳[23]认为蛋白酶是酱油风味形成的关键酶,能将大豆中的蛋白质降解为氨基酸、多肽等[24],对风味及滋味有着重要作用陈怡等[25]将蛋白酶活力作为选择浏阳豆豉发酵菌株的重要指标选择蛋白酶活力高的菌株,对于提高发酵豆制品的风味质量具有重要意义2.1.3 菌株脂肪酶活力在腐乳发酵过程中,脂肪酶将脂肪分解为甘油和脂肪酸,然后进一步转化为有机酸,这些有机酸与醇反应形成的酯,对腐乳的风味形成起着重要作用[24]。
菌株脂肪酶活力如图1-c所示大多数菌株的脂肪酶产量在0～60 h迅速增加,然后逐渐下降CJ-6的脂肪酶活力最强,最高酶活力为(15.970±0.342)U/gCJ-6在6株雅致放射毛霉中,生长旺盛,有最高的蛋白酶和脂肪酶活力,表明CJ-6具有作为腐乳发酵菌株的潜力2.2 人工接种CJ-6对腐乳风味的影响2.2.1 感官评价参考CHEN等[13]的方法,略作修改,增加了鲜香、辣椒香、甜香、酸香和刺激5个描述词,如表1所示对5种腐乳进行定量描述性分析(quantitative descriptive analysis, QDA),结果如图2所示,5种腐乳在酒香、辣椒、霉味属性上有显著差异(P<0.05)表1 腐乳香气特征、定义及参比样图2 腐乳感官结果雷达图对QDA结果进行。