单击鼠标编辑标题文的格式,单击鼠标编辑大纲正文格式,第二个大纲级,第三个大纲级,第四个大纲级,第五个大纲级,第六个大纲级,第七个大纲级,第八个大纲级,第九个大纲级,*,鱼中结晶紫的检测方案,工分专122,张启阳,、尹彬竹、向乾元、魏俊,前言,结晶紫,属于三苯甲烷类染料，化学性质,，,暗绿色闪光粉末或粒子溶于冷水和热水，呈紫色，极易溶于乙醇于浓硫酸中呈红黄色，稀释后呈暗绿光黄色，然后转变成蓝和紫色,，,结晶紫,这种化合物对鱼类的水霉病、寄生虫病等有很好的疗效，长期以来许多国家曾将其作为水产养殖业的杀菌剂它们在鱼体内可分别代谢为和无色结晶紫，由于其母体化合物和代谢物均具有潜在的致癌、致畸、致突变等副作用，20世纪90年代 以来许多国家都将其列为水产养殖的禁用药物但 是由于其抗菌效果好、价格便宜，不少业户仍在违规使用，因此,结晶紫,残留监控就显得格外重要实验,材料,与方法,试验结果,结果讨论,结晶紫,的,检测,方案,1,2,3,样品,的,提取,的,保存,试剂和溶液,鲈鱼，,从,超市,里,购买,鲈鱼,活样品，取其肌肉，各自用均质机混均，每个样品各400 g，于-20 冰箱保存备用样品,与方法,结晶紫标准品：纯度 93.9%；结晶紫快速检测前处理试 剂盒，由中国检验检疫科学研究院北京陆桥商检新 技术公司生产。
酸性氧化铝固相萃取柱（500 mg，3 mL），PRS固相萃取柱（500 mg，3 mL），乙腈为 色谱纯，无水乙酸铵、冰乙酸、对-甲苯磺酸、乙酸 钠、硼氢化钾均为分析纯，实验用水为去离子水孔雀石绿乙腈 溶液;结晶紫标准储备液：100 g/mL结晶紫乙腈溶液;、结晶紫混合标准中间溶液：10 g/mL;乙酸钠缓冲液：0.06 mol/L乙酸钠+0.005 mol/L 对甲苯磺酸，pH4.5;乙酸铵缓冲溶液：0.125 mol/L，pH 4.5;硼氢化钾溶液：0.07 mol/L，现配现用;洗脱液：乙酸乙酯甲醇氨水体积比1091,样品预处理,提取,：准确称取 5.00 g已搅碎的样品于 50 mL 离心管中，加入结晶紫快速检测前处理 试剂盒中提取剂 1（20mL，由有机化学试剂组成的 混合液体试剂）和提取剂 2（由无机化学组成的混 合粉末试剂），8 000 r/min的速度均质 30 s，振荡 2 min，4 500 r/min 离心 5 min，取上清液 10.0 mL 于 鸡心瓶中，45 水浴旋转蒸发至近干，用 2.5 mL 乙腈溶解残渣净化:,将,PRS 柱安装在固相萃取装置上，上端串联酸性氧化铝柱，用 5 mL 乙腈活化，转移提取液到柱上，再用 2.5 mL 乙腈洗涤瓶一次，过柱，重复操作一次，去掉酸性氧化铝柱，用 5 mL 乙腈,清洗PRS,柱，,氮,吹PRS,柱,至,近,干,，,在,不抽,真空,清况下，加入 5 mL 洗脱液洗脱，收集全部洗脱液，氮气吹至近干，加 0.4 mL 硼氢化钾溶液，还原，静置 20 min，用乙腈定溶至 1.0 mL，经聚四氟乙烯,膜,过滤后上机分析,实验,方法,的,选择,目前结晶紫检测方法主要有高效液相色谱法1-3和液质联用法4-5。
我国 于2006年发布有关的水产行业标准（SN/T1768-2006）6及国家标准（GB/T20361-2006）7行业 标准SN/T1768-2006前处理简单，但是满足不了检 测限0.5 g/kg的要求其他方法的前处理均需多次萃取，多次离心，操作烦琐，前处理时间长，有机 溶剂用量大，实际检测工作中存在困难本文综合各个方法标准中快速和灵敏的优点，建立了同时检测，结晶紫以及代谢物无色结晶紫总量的,高效液相色谱,法,仪器：Agilent1200 型高效液相色谱仪、均质机、离心机、振荡器、旋转蒸发器、固相萃取装置、氮吹仪色谱条件：色谱柱，Eclipse-C18 250 mm4.6 mm，粒度 5 m；流动相，乙腈+乙酸铵缓冲液（pH 4.5）=80+20；流速 1.5 mL/min；柱温 35；激发 波长 265 nm,发射波长 360 nm；进样量 20 L,仪器与色谱条件,在临用前准确吸取一定量的混合标准中间溶 液，加入 0.4 mL 硼氢化钾溶液，用乙腈准确稀释至 2.0mL，配制适当浓度的混合标准工作液在上述 色谱条件下，分别测定结晶紫混合标准工作溶液及样品提取溶液中的结晶紫，外标法定量。
样品测定,准确度和精密度实验,以本底无结晶紫、隐性结晶紫的鲈,鱼,为样品，平行称取3份样品，按5 g/kg、10 g/kg、20 g/kg三个加标浓度进行加 标，按上述步骤进行前处理和色谱测定，分别测定 各次的峰面积，计算样品中结晶紫的含量，计算回收率另取 6 个平行样品，采用添加法分别添加等量结晶紫混合标准溶液，按上述步骤进行 前处理和色谱测定，分别测定各次的峰面积,计算样 品中结晶紫的含量，计算相对标准偏差计算,以标准工作液峰面积和浓度作工作曲线，根据 样品提取液的峰面积，从工作曲线计算样品提取液中结晶紫的残留量，按式计算样品中 结晶紫残留量计算结果需扣除空白值X=(CxVx2)/m,式中：X试样中的结晶紫的残留量，g/kg；,C样品提取液中结晶紫的残留量，ng/mL；,V最终定容体积，mL；,m样品质量，g实验结果,结晶紫标准色谱图 本实验选定色谱条件下、结晶紫的保留时间分别为为 7.9 min、8.5 min 左右，图 1 为标 准溶液浓度为 30 ng/mL 的标准色谱图,以 HPLC 测得的峰面积 y为纵坐标，相应的浓 度 x为横坐标绘制标准曲线，其线性关系和相关系数见表 1。
结果表明，结晶紫在 1.0 ng/mL500 ng/mL 范围内线性良好，可以满足定量分析的需要关系数,表 1 线性回归方程、相,、线性范围,标准曲线,化合物,线性回归方程,相关系数,线性范围,结晶紫 GV,y=0.9834x-3.7908,0.9996,1.0500,回收率、精密度和灵敏度,鲈,鱼,空白肌肉组织样品中分别添加3个浓度 水平的结晶紫标准溶液，进行回收率测定，回收率测定结果见表 2，加标样品图谱见图 2由表 2 可以看出,，,结晶紫加标浓度在 5 g/kg20 g/kg 内，回收率为 76.1 92.5六个平行样品测定结果的相对标准偏差（RSD）分别为：结晶紫，4.5，重现性能满足要求以信噪比 S/N=3 计算，样品中结晶紫的检出限均为 0.5 g/kg讨论,净化条件的选择,样品经孔雀石绿快速前处理试剂盒提取后，如果不进一步净化，直接上机用荧光检测器检测，干扰严重目前文献资料中多采用氧化铝柱（酸性、中性或碱性）与 PRS 小柱串联来对样品进行净化1,2,5,7我们分别采用正己烷，酸性氧化铝柱 与 PRS小柱串联，对样品进行了净化，实验中发现，用正己烷脱脂效果差，干扰严重，用酸性氧化铝和 PRS 小柱串联净化效果好，所以实验中采用酸性氧 化铝柱与 PRS 小柱串联进行净化，过 0.45 m膜后 上机检测。
与文献相比，本实验经过一次萃取后无 需二氯甲烷反萃取，浓缩后直接用小柱进行净化，同样获得了较理想的实验结果流动相的选择,实验中分别采用（1）乙腈+乙酸钠缓冲,液,（pH 4.5）=80+20；,（2）乙腈+乙酸铵缓冲液（pH 4.5）=80+20 为流动相进行检测，实验结果表明,用流动相（1）进行检测时基线噪音大，对检测结果有干 扰，,用流动相（2）进行检测时基线噪音小，对 检测基本无干扰小结,样品经孔雀石绿快速前处理试剂盒提取，固相萃取柱净化，硼氢化钾还原，高效液相色谱-荧光检 测法进行检测，成功地进行了水产品中结晶紫残留量的检测试验结果表明：该方法主要 综合了各个方法标准中快速和灵敏这两个优点，并 对前处理过程进行了优化，相对于SN/T1768-2006 及文献1，2来说，检测限从2.0 g/kg提高到了 0.5 g/kg，而相对于GB/T20361-2006及其它文献来 说，前处理大为简化，大大缩短了检测时间，减少了有机溶剂用量，灵敏度与国标7及液质联用方 法5相当（均为0.5 g/kg），是水产品中结晶紫及其代 谢物隐色结晶紫残留总量快速而准确的检测方法参 考 文 献,1 任秀莲，魏琦峰，曲径，等.反相高效液相色谱法测定水产品中孔 雀石绿、结晶紫及其代谢物J.中国卫生检验杂志,2006,l6(8):939-940.,2 林洪，付晓婷，邱绪建,等.液相色谱法测定鱼肌肉中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物J.中国海洋大学学报,2006,36(6):909-912.,3 朱宽正,王鹏,林雁飞，等.液相色谱一串联质谱法同时测定水产 品中孔雀石绿、结晶紫以及它们的隐色代谢物残留J.色谱,2007,25(1):66-69.,4,贾东芬，张顺合，张维，等.SN/T1768-2006,水产品中孔雀石绿和 结晶紫及其代谢产物的快速测定方法S.北京：中国标准出版社，2006.,5 郑斌，赵红萍，冷凯良，等.GB/T20361-2006,水产品中孔雀石绿 和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法S.北京：,Thank you!,。