按一下以編輯母片標題樣式,按一下以編輯母片,第二層,第三層,第四層,第五層,*,Candida rugosa lipase的表現及特性分析PDB ID:1CRL,林柏宏,11月26日,Candida rugosa lipase的表現及特性分析,1,Introduction,Candida rugosa,所產生的五種菌体外脂肪酶(LIP-1LIP-5)，皆為534個胺基酸，且在序列上具有高度的相似性，但卻有不同的基質特異性，由此可知CRL的序列與結構及基質特異性的相關性可能是非常嚴謹的IntroductionCandida rugosa所產生的,2,脂肪酶的生化特性,A、催化之反應,酯解反應(Ester Hydrolysis),酯化反應(Ester Synthesis),內酯化作用(Intererterification),B、水解催化的特異性,非特異性脂肪酶(non-specific lipase),1,3-特異性的脂肪酶(1,3-specific lipase),2-特異性脂肪酶(2-specific lipase),醯基特異性脂肪酶(Acyl group specific lipase reaction),C、催化機制,醯化反應(acylation),去醯化反應(deacylation),脂肪酶的生化特性A、催化之反應,3,脂肪酶的結構特性,/水解酵素摺疊構形(/hydrolase folding),催化三元体(catalytic triad),為S209，H449，E341,含氧陰離子洞(Oxyanion hole),為G124，A210,頂蓋(Lid domain),位置6292AA,脂肪酶的結構特性/水解酵素摺疊構形(/hydro,4,1CRL,-helix(red),and,-sheet,(yellow),1CRL-helix(red),5,Lid(green)、,氧陰離子洞(orange),、催化三元体(purple),Lid(green)、氧陰離子洞(orange)、催化三元,6,(A)Closed(inactive)form，黑色部分為胺基酸的位置62 92所形成的頂蓋(Lid domain)。
B)Open(active)form，黑色部分為胺基酸的位置62 92所形成的頂蓋(Lid domain)A),(B),(A)Closed(inactive)form，黑色部分,7,We can analyze,可以改變lid domain對受質的特異性以及活性有顯著的影響將LIP的tunel部分的胺基酸突變後，以不同的triacylglycerides來觀測基質特異性的差異LIP的序列以基因重組的方法，產生新式脂肪,酶跟原本比較之間的差異，看看是否能提高熱穩定性和活性各個脂肪酶胺基酸序列相同度的比較We can analyze可以改變lid domain對受,8,脂肪酶的结构特性课件,9,脂肪酶的结构特性课件,10,脂肪酶的结构特性课件,11,相似的程度,相似的程度,12,脂肪酶的结构特性课件,13,Lid,Lid,14,結晶結構發現脂肪中的頂蓋部位(lid domain)胺基酸序列差異頗大，因此以LIP4(19)/lid1，lid2，lid3與lid5分別轉型入P.pastoris系統，並將得到的脂肪進行酵素動 力學以及活性測試，結果發現改變lid部位對脂肪的受質特異性以及活性都有顯著的影響。
如在置換為lid2時，對triolein的活性可增至wild type的5倍，而置換為lid5時，則為 wild type的2倍但在lid1及lid3中則無明顯增加同時在esterase活性中，只有lid2的活性提升，lid1，lid3及lid5的活性皆下降，由此證明lid部位對C.rugosa脂肪的功能，具有顯著的影響結晶結構發現脂肪中的頂蓋部位(lid domain)胺基酸序,15,脂肪酶的结构特性课件,16,脂肪酶的结构特性课件,17,Lip 1的Lid,Lip 1的Lid,18,CRL的Lid兩種結構open為紫色 closed為藍色,CRL的Lid兩種結構open為紫色 closed為藍色,19,有於Lid domain有hydrophobic moment 而又以LIP4最高，所以Lid在LIP的interfacial activation過程扮演重要角色,所以置換不同的Lid會呈現不同的物理性質，如蛋白質的表面的淨電荷和疏水性,從模擬結構中可以看到活化能高低以及鄰近區的靜電力作用力，會決定該LIP的活化速率,有於Lid domain有hydrophobic momen,20,可以看到Lid以帶正電的Lys75與蛋白質表面帶負電的Asp292形成氫鍵及靜電力。
此作用使Lid維持打開的狀態,，進而穩定open的結構,可以看到Lid以帶正電的Lys75與蛋白質表面帶負電的Asp,21,而Lid2上帶電荷殘基分布與Lid4相似所以酵素動力學特性跟Lip4相近而Lid2上帶電荷殘基分布與Lid4相似22,以下置換Lid1、Lid3、Lid5由於帶電荷殘基的分佈情形與Lid4不同可以看到Lys75與Asp292的靜電引力受到Glu71的干擾，因此呈現較差的催化的效率以下置換Lid1、Lid3、Lid5由於帶電荷殘基的分佈情形,23,脂肪酶的结构特性课件,24,脂肪酶的结构特性课件,25,以上的電腦分析的結果，發現了幾各與LIP活化過程相關的重要胺基酸所以可以提供以後做site-directed mutagenesis的實驗，可以進步了解LIP的結構與功能間的關係以上的電腦分析的結果，發現了幾各與LIP活化過程相關的重要胺,26,。