技术路线图接种米 「 致病性测病 [采样f菌种分离f纯培养f ＜妥玉' T]鉴别寄主—划分生理小种J〜 〜得出DNA指纹图谱成像T结论1.1采样1.1.1 采样地点 成都，射洪，达州，南充，郫县，广元，内江，绵阳，三台，筠连，宜宾，雅安，渠县，武 胜，西昌，资阳，峨边，德阳，营山，资中邻水（广安市）、大竹（达州市）、南充、仪陇（南充市）、广元丹巴 （甘孜州）、筠连（宜宾市）、屏山 （宜宾市）、雷波 （凉山州）、叙永 （泸州市）、 汉源（雅安市）1．1．2 采样方法在各采集地点按品种、症状表现采集 15-20 个样本，样本为玉米发病叶（不需考虑叶片为第 几片叶）2.1 菌种的分离采用组织分离的方法进行菌种分离：1、 从各地采回的样本中分别挑选具有代表性的叶片，从病斑切取每边约5 毫米的小块病组 织，用70%的酒精浸几秒钟，再在0.1%的酸性升汞水溶液中处理 3-5分钟；而后用灭菌 水换洗三次，将其移置在马铃薯蔗糖琼胶培养基（PD）（见附表1）平板上培养2、 液体平板静置培养法 挑取适量菌丝体移入装有马铃薯蔗糖液体培养基的培养皿中， 装液量为培养皿容量三分之一，接种菌丝体悬浮于液体培养基表面，25°C培养3〜4d； 当病菌在液体培养基上形成菌落，用灭菌牙签挑取菌落，无菌水冲洗一次，吸去多余水 分，将菌体（菌丝和抱子）收集于离心管中，用冷冻干燥机- 110C冻干2〜3d，研磨成 粉，供 DNA 提取用。
3.1 菌种的纯培养3.1菌种的纯培养菌种经组织分离得到单一菌株后分别接种到马铃薯蔗糖琼胶培养基（PD）平板上培养培养皿需注明菌种和种类，采集时间，采集地点4.1 病菌的接种4.1.1 实验田的化分4.1.2 接种液制备3、 待培养基上扩繁的病菌长出分生抱子时，取出培养基并用灭菌水冲洗，制成抱子悬浮液，（抱子悬浮液的配制可用清水或2%的蔗糖溶液，）抱子浓度1*105~1*106个\ml,滴加 0.1%吐温振荡摇匀即可用于接种4．1 ．3 接种待幼苗长至8~10叶期时，进行喷雾接种接种后保湿24h,然后室温进行正常管理，室内 温度控制在25C左右接种两周后进行发病调查15（2）：123~126 玉米大、小叶斑病的接种一般采用苗期接种方法：选择产生抱子的和致病性较强的菌株，在 培养基上繁殖，洗下抱子配成悬浮液病叶采回保湿，促使抱子产生，也可用来接种抱子悬浮液的配制可用清水或 2%的蔗糖溶液，接种时将孢子悬浮液喷在幼苗上，保湿 12-16 小 时，一般是在接种后 7-14 天记载玉米大斑病的接种可采用如下简单方法：在雄穗抽出后 4-6 周，从感病的品种上采取病叶， 在空气中充分干燥后磨成细粉，在低温干燥的条件下保存。
当待测定的玉米生长到40-60 厘 米高时，将少量粉状病叶组织放在喇叭口中，或撒在叶面上（叶背面），最好是在降小雨或 降雨前，或者有露水的时候接种在整个生长季中，可以接种二三次试验田最好布置若干 感病品种，接种发病后作为再侵染的病源少量植株的大田接种，也可以将孢子悬浮液喷叶 面或者灌在喇叭口中4.2.1 致病性的测定采用感染指数法测定致病性感染指数=X100工（病级株数X代表数值）株数总和X发病最重级的代表数值感染指数=(0 x 8 + 1 x 15 + 2 x 20 + 3 x 40 + 4 x 30) x 100(8 + 15 + 20 + 40 + 30) x 4295 x 100113 x 4=65.3例如，番茄早疫病的病株，可根据发病程度分为五级，每一级用一数值代表，如下表 1表 1 番茄早疫病病株的分级病级发病程度代表数值株数1顽症或者几乎没有病082少至25%的叶片枯死115326-50%的叶片枯死220451-75%的叶片枯死340576-100%的叶片枯死430*项内的株数是假定的发病最重的感染指数是100，完全无病是 0，所以这数值就能表示发病的轻重同理，我们可以用感染指数法分级玉米大、小斑病的致病能力。
如下表 2表 2 玉米大、小病病株的分级病级发病程度代表数值株数0.5轻微侵染，只有下部叶片有1-2个病斑0*1.0轻微侵染，下部叶片有少量分散的病斑1*2.0轻度侵染，下部叶片有中等数量的病斑2*3.0中等侵染，下部叶片病斑很多，中部叶片也有少量 病斑3*4.0重度侵染，下部和中部叶片病斑很多，发展到上部 叶片4*5.0极度侵染，所有叶片上都有大量病斑，病株可能在 成熟前枯死5*4.3.1 鉴别寄主采用化分级数的方法表示寄主的抗性表 3 玉米的抗性级别级别抗性症状0级不发病0E级不发病但也可能是避病1级抗病只有最下面叶片有少数分散的病斑2级抗病最下面叶片轻度发病，下面第一叶片上有分散的病斑3级抗病下面叶片第三叶片轻度发病，最下面叶片发病中等或较重4级中抗下面叶片中度到轻度发病，扩展到中点，中点下叶片轻度发病或只 有分散的病斑5级中感下面叶片严重发病，中点下叶片轻度或中度发病，中点以上叶片不 发病6级中感植株下面1/3部分严重发病，中点叶片中度发病，中点以上叶片有 零星病斑7级感病中点和中点卜叶片严重发病，上面病害扩展到剑叶卜面的叶片，或 剑叶也有少量侵染8级感病中叶和中叶下叶片严重发病，植株上部1/3部分中度或严重发病， 剑叶发病显者9级高感所有叶片都严重发病，穗状花序也有一定程度发病4.3.2 刬分生理小种5.1基因指纹图谱分析5.1.1病菌DNA提取 采用CTAB法提取病菌DNA，溶于适量TE后，于-20T下保存。
5.2.1RAPD 反应及电泳供试引物、dNTP和Tap酶均由XX公司生产DNAMarker DL2000为Takara公司生产根 据3次重复PCR的试验结果、扩增产物特异带有无和重复等标准，筛选出扩增效果较好的 引物PCR反应总体积为2 5 p 1,反应体系中含1 0 X PCR缓冲液(500mmol/L Tris-HCL,25mmol/LMgCL2) 2.5p L, dNTPlp L(2.5mmo1/L),Tap 酶 0.5p L(2U/p L),引物 2 p L(4p mol),DNA 模板1 p L (10 ng/p L) ,ddH2O 18p LPCR反应程序 预变性94°C10mn；扩增94°C20s , 37C3 0s ,72C80s,,共4 0个盾环；延申7 2°C 1 0mho程序结束后取出1 0p L扩增产物在1 . 2 %琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1XTB E,电压为4V/cm电泳结束后，在紫外凝胶成像系统上观察，保存图像5.3.1 数据统计分析每条RAPD带均看作一个遗传位点，根据某一 DNA片段在样品中出现赋值“ 1”和不出 现赋值“0”组成“1, 0”资料表。
根据NTMAS中的Jaccard公式计算各菌株间的遗传相似 系数(Gs),应用平均距离法(UPGMA)进行聚类分析，对0, 1数据数量化处理，通过 NYSYS version 2.1 程序运算建立聚类图5.4.1 数据 通过相似性系数、遗传距离的聚类图分析，能够比较出各菌株间的遗传亲缘关系，同时按不 同的相似率划分出不同的基因组若要明确病菌的生理小种，可根据菌株在DNA水平上的 差异结果，同时利用传统的鉴别寄主的致病性测定来实现菌种的保存菌种的保存可采用燕麦片玉胶培养基（配方见附表 2）保存或矿物油下保存附表 1铃薯葡萄糖琼胶培养基（PDA）配方：马铃薯20g 葡萄糖（蔗糖）10-20g 琼胶17-20g 水1000毫升附表2燕麦片玉胶培养基配方：燕麦片30g 琼胶17-20g 水1000毫升参考文献：[1] 唐海涛，林勇，叶国成，陈婉秋，张彪•四川省玉米杂交综合评价及主要农艺性状的关 联度分析J]（） •玉米科学，2007, 15 （1）： 48~52[2] 姚启伦，许江，许冬梅，陈秀娟•四川及重庆玉米地方品种遗传多样性的比较分析J] •湖南农业大学学报（自然科学版），2008年2月，第34卷第一期：2[3] 方中达。
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