第五章 花药和花粉培养 大 家 好 ！植物组织培养花药和花粉培养第五章 花药和花粉培养 本章主要内容：l花粉和花药培养的概念和应用l花粉小孢子发育途径l花粉和花药培养方法 l单倍体植株鉴定和染色体加倍 第5章 花药和花粉培养花药和花粉培养第一节 花粉和花药培养的概念和应用l花粉和花药培养的概念l花药和花粉培养的历史l花粉和花药培养的应用花药和花粉培养花粉和花药的培养(pollen and anther culture) 是指在人工合成培养基上，改变花粉的发育途径, 使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂分化，由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术第5章 花药和花粉培养单倍体植物(haplobiont)用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株花药培养、花粉培养；胚珠或子房培养（未受精）一、概念花药和花粉培养第5章 花药和花粉培养花药和花粉培养异同点：l相同点：二者培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株l不同点：花药培养属器官培养，花药是植物花的雄性器官，包括体细胞性质的药壁和药隔组织，以及雄性性细胞的花粉粒花粉培养属细胞培养: 花粉培养没有药壁组织干扰； 可计数小孢子产胚率； 可观察雄核发育的全过程； 单倍体产量高。
但技术更复杂，比花药培养难度大花药和花粉培养二、植物花药/花粉培养历史lGuha和Maheshwari （1964） 曼陀罗花药培养lNitsch 和 Norreel (1973) 烟草花粉培养（游离小孢子培养） Chu（1973）小麦花粉培养（早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体，能自发形成胚胎发生的基因频率较低，效率极低）l80年代后期到90年代期间，花培技术迅速发展许多作物小孢子培养已经成功十字花科、麦类、水稻、玉米等l90年代，一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续成功Konzak (1999) 花药和花粉培养通过花药培养育成的甜椒新品种：海花三号 花药和花粉培养三、花药和花粉培养的应用1)诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；第5章 花药和花粉培养供体植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株DH（2n）一年内获得纯系常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年1、作物育种花药和花粉培养常规育种在杂交F5、F6代开始选择；花药培养在F1或F2代进行培养，再人工加倍处理缩短育种周期3-5年克服后代分离，大大缩短育种周期第二节 花药和花粉培养的应用花药和花粉培养 花粉单倍体是纯合配子体，从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是(1/2)n，而从常规杂交F2代群体中，选择某一基因型的概率为(1/2)2n，故单倍体育种的选择效率为常规育种的2n倍。
2) 提高目标基因型的选择效率提高目标基因型的选择效率花药和花粉培养例子： 二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株 常规方法： AAbb出现的概率为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开 AB aB Ab abABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBB aABb aaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabB aAbb aabb花药和花粉培养例子： 二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法： AAbb出现的概率为1/4 单倍体 二倍体AB- - AABBaB- aaBBAb- AAbbab- - aabb供体亲本AaBb花培 从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是(1/2)n，而从常规杂交F2代群体中，选择某一基因型的概率为(1/2)2n，故单倍体育种的选择效率为常规育种的2n倍花药和花粉培养l l 3)诱变育种中的作用诱变育种中的作用植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，染色体加倍后成为稳定的纯系花药和花粉培养 可探索亲本染色体组的构成。
分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体 2、物种进化研究 花药和花粉培养 单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来能用来研究基因的性质及其作用还可用于基因的剂量效应分析3、遗传分析 花药和花粉培养4、构建连锁图谱 双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建花药和花粉培养l能直接表达外源基因，不受显隐性影响5、用于遗传转化 花药和花粉培养第二节 花粉孢子体发育途径l概念：花粉孢子体发育途径（雄核发育途径） 花粉是产生花粉植株的原始细胞，其第一次有丝分裂，在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似，把花粉形成植株的途径称为花粉孢子体发育途径，也叫雄核发育途径花药和花粉培养一、花粉发育的阶段花粉离体培养时，雄核发育最适宜的时期一般是第一次有分裂或之前花药和花粉培养二、雄核发育途径1、A途径 小孢子第一次有丝分裂为非均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞 （1）A-V途径 由营养细胞重复分裂形成单倍体 （2）A-G途径 由生殖细胞重复分裂形成单倍体 （3）A-VG途径（E途径） 由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体 （4）C途径 营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株2、B途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。
然后由这两细胞边续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株花药和花粉培养花药和花粉培养1、雄核发育与P花粉的形成P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核发育与饥饿处理饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育三、雄核发育启动机理花药和花粉培养1、胚状体发育途径 小孢子经历胚发生的各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株2、愈伤组织发育途径 小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂四、花粉植株形态发生方式花药和花粉培养胚状体发育途径部分花药通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养花药和花粉培养通过胚状体途径再生形成小植株烟草花药培养花药和花粉培养胚状体发育途径a) 球形胚 d) 鱼雷形胚芸苔属小孢子培养花药和花粉培养愈伤组织发育途径部分花药产生愈伤组织接种在平板上的水稻花药水稻花药培养花药和花粉培养愈伤组织转接种到再生培养基愈伤组织分化形成再生植株水稻花药培养花药和花粉培养第三节 花粉和花药培养方法l一、花药培养l二、花粉培养l三、白化苗现象l四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素花药和花粉培养一、花药培养l1、取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。
l 2、消毒 70酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡30-60s后在1次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次l 3、培养 固体或液体培养基均可先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚或愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；后转入分化培养基培养，形成小植株花药和花粉培养二、花粉培养l(一)花粉的分离与纯化 l1、自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法) 将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养l2、挤压法 在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养花药和花粉培养1）磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；2）超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）l4、小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子3、机械游离花药和花粉培养梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）30%蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）花药和花粉培养(二)花粉培养方式l1、平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养l2、液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。
l3、双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养 培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基 花药和花粉培养l4、看护培养 l 利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使l其生长和增殖这个愈伤组织块称为看护愈伤组织花药和花粉培养1）在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基，灭菌后备用2）在无菌条件下，将一小块（1cm3）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织块上放一片（1cm）已灭菌的滤纸，放置过夜3）将分离的花粉接种到已经充分吸收愈伤组织渗透液的滤纸上4）单细胞分裂形成肉眼可见的小细胞团后，即转移到新鲜培养基上培养，恒温培养，得到单细胞无性系具体方法2.花药和花粉培养看护培养图解花药和花粉培养l5、微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养l6、条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养花药条件培养基、子房条件培养等花药和花粉培养微室培养图示：1滴含单细胞培养液周围加石蜡油旁边各加石蜡油盖盖玻片盖盖玻片平视图凹穴载玻片置培养皿中2628 恒温培养花药和花粉培养花粉培养过程取花蕾（镜检）预培养数天取花药消毒分离花粉第一节 花药和花粉培养技术接种培养愈伤组织发生花药和花粉培养三、白化苗现象花药和花粉培养（一）白化苗产生的影响因素及机理1、内因供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。
2、外因预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等3、机理核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗另外地、无性系变异也可能是原因之一花药和花粉培养（二）白化苗的控制 l通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控花药和花粉培养四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素l（一）基因型 植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大 如在水稻中，籼稻花粉培养力远低于糯稻花药和花粉培养小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要三）花粉发育时期适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期)花药和花粉培养芸苔属植物Brassica napus不同基因型的小孢子产胚率比较Topas 10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,000 0.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty 10-100 0.001-0.01基因型胚状体数量/106小孢子 成苗率（%）花药和花粉培养1、植株生长条件 光温等因素均能影响花药培养力一般 处于适宜生长条件（如温室中）较好但物种间存在差异2、植株生长时期 一般是开花始期优于开花末期。
3、P花粉的频率 不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高P花粉的数量 （二）供体植株生长条件和生理状态 花药和花粉培养l随着细胞体积迅速增大，细胞核由中央位置推向一边，即单核靠边期雄配子体的发育 营养细胞生殖细胞精子花药和花粉培养四分体: 醋酸洋红染色四分体: Alexanders 染色单核期双核期成熟花粉粒处于不同发育时期的烟草小孢子花药和花粉培养单核晚期液泡第一次有丝分裂后期双核早期双核中期生殖核生殖核营养核花药和花粉培养一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期形成双核后，在合适的条件，主要由营养细胞分裂产生胚状体 花药和花粉培养不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期发育时期物种减数分裂期草莓、番茄四分孢子期葡萄单核早中期石刁柏、油菜、大麦、天仙子、马铃薯单核晚期荔枝、茄子、青椒、小麦单核早期至晚期烟草单核早期至双核期梨、水稻、甘蓝四分孢子期至双核期玉米花药和花粉培养l对不同发育阶段的花药进行培养测试l确定最佳小孢子发育时期的形态特征l注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化处于不同发育阶段的烟草花芽 花粉发育时期的确定花药和花粉培养单核期的确定：l 根据细胞观察推测，双核期的花粉中。