•In-Fusion克隆技术介绍•宝日医生物技术（北京）有宝日医生物技术（北京）有限公司限公司8/17/2024[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •主要内容主要内容 1In-Fusion®技术原理技术原理 3In-Fusion®应用实例应用实例 4In-Fusion®应用文献用文献 2In-Fusion®实验方法实验方法8/17/20242[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®技术原理示意图技术原理示意图In-Fusion酶酶Clontech专利专利50 ℃℃，，15 min单管反应单管反应8/17/20243[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®技术特点技术特点In-Fusion不受不受载体限制体限制不受不受酶切位点限制切位点限制不附加任何冗余序列不附加任何冗余序列一次反一次反应单管操作管操作阳性率高阳性率高达达80%8/17/20244[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •主要内容主要内容 1In-Fusion®技术原理技术原理 3In-Fusion®应用实例应用实例 4In-Fusion®应用文献用文献 2In-Fusion®实验方法实验方法8/17/20245[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •实验方法实验方法传统基因克隆操作流程传统基因克隆操作流程In-FusionIn-Fusion基因克隆操作流程基因克隆操作流程8/17/20246[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®引物设计原则引物设计原则同源序列部分是与线性化载体末端同源序列部分是与线性化载体末端5’end前前15 bp相互补的碱基序列相互补的碱基序列黏性末端无需黏性末端无需进行末端行末端补平平若保留若保留酶切位点，需切位点，需补齐酶切位点缺失碱基切位点缺失碱基8/17/20247[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®引物设计引物设计------原则原则1 1黏性末端黏性末端（（5’ 5’ 悬挂）悬挂）黏性末端黏性末端（（3’悬挂）悬挂） 平末端平末端8/17/20248[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®引物设计原则引物设计原则同源序列部分是与线性化载体末端同源序列部分是与线性化载体末端5’end前前15 bp相互补的碱基序列相互补的碱基序列黏性末端无需黏性末端无需进行末端行末端补平平若保留若保留酶切位点，需切位点，需补齐酶切位点缺失碱基切位点缺失碱基8/17/20249[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®引物设计引物设计------原则原则2 2黏性末端黏性末端（（5’ 5’ 悬挂）悬挂）黏性末端黏性末端（（3’悬挂）悬挂） 平末端平末端8/17/202410[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®引物设计原则引物设计原则同源序列部分是与线性化载体末端同源序列部分是与线性化载体末端5’end前前15 bp相互补的碱基序列相互补的碱基序列黏性末端无需黏性末端无需进行末端行末端补平平若保留若保留酶切位点，需切位点，需补齐酶切位点缺失碱基切位点缺失碱基8/17/202411[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®引物设计引物设计------原则原则3 3补齐酶切位点补齐酶切位点部分部分缺失碱基缺失碱基8/17/202412[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®引物设计工具引物设计工具在工具网址工具网址 片段与片段与载体用量体用量计算工具算工具PCR引物引物转换工具工具8/17/202413[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •载体线性化载体线性化PCR扩增扩增酶切处理酶切处理8/17/202414[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •建立建立In-Fusion®连接体系连接体系Rxn ComponentCloning Rxn5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μlLinearized Vector x μl*Purified PCR Fragment x μl**dH2O x μlTotal Volume 10 μlLinearized vector : Purified PCR fragment(Linearized vector : Purified PCR fragment(摩摩摩摩尔尔比比比比)=)=1:21:2*<0.5 kb: 10-50 ng, 0.5 to 10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng*<0.5 kb: 10-50 ng, 0.5 to 10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng**<10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng**<10 kb: 50-100 ng, >10 kb: 50-200 ng8/17/202415[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •主要内容主要内容 3In-Fusion®应用实例应用实例 1In-Fusion®技术原理技术原理 4In-Fusion®应用文献用文献 2In-Fusion®实验方法实验方法8/17/202416[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®应用应用多片段克隆插入突变位点构建载体模型高通量克隆8/17/202417[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®应用实例应用实例 In-FusionTM assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. Baogong Zhu, Guifang Cai, et al. BioTechniques, Sep 2007; 43:354-3598/17/202418[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®应用实例应用实例------多片段连接多片段连接多片段连接多片段连接------构建真正无缝融合蛋白构建真正无缝融合蛋白 将白将白细胞介素胞介素2 (IL-2)分泌信号序列与分泌信号序列与CD101胞外域序列（胞外域序列（删除内源性除内源性信号序列）和鼠免疫球蛋白信号序列）和鼠免疫球蛋白 G3 (IgG3)的可的可结晶片段晶片段进行融合，构建无行融合，构建无缝融融合蛋白合蛋白IL-2 signal-CD101-Fc ，并将其，并将其转染染COS细胞胞检测表达情况。
表达情况实验流程流程1.设计引物；引物；2.扩增目的片段及增目的片段及载体体线性化；性化；3.建立In-Fusion连接反接反应体系体系8/17/202419[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®应用实例应用实例------多片段连接多片段连接引物引物设计并并扩增目的片段增目的片段IL-2 Signal, CD101和和Murine IgG3 IL-2 Signal with Overlaps to NcoI-Digested Vector and CD101, 88-bp PCR ProductSense (NcoI underlined)5′-TTCAAATCCACCATGGATAGAATGCAATTGTTG-3′Antisense5′-CTGTTACTTCTCTCTGAGAATTCGTAACCAAAGCCAAAGACAAAGCAATCA-3′CD101, 2799-bp PCR ProductSense5′-CAGAGAGAAGTAACAGTTCAGAAA-3′Antisense5′-GGCCGAGGAGCAGATCCTGGAA-3′Murine IgG3 with Overlaps to CD101 and SalI-Digested Vector, 771-bp PCR ProductSense5′-ATCTGCTCCTCGGCCCCTAGAATACCCAAGCCCAGTACC-3′Antisense (SalI underlined)5′-AGTAACGTTAGTCGACTCAGTGTCTTGTAAGACCCGAGGA-3′8/17/202420[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®应用实例应用实例------多片段连接多片段连接建立建立In-Fusion连接反接反应体系（体系（ 10 μl ））IL-2 Signal CD101 Domain Murine IgG3 Fc Tail Vector Total Transformants Error-Free/ Sequence (No.)88 bp, 1.6 ng 2799 bp, 49.3 ng 771 bp, 13.6 ng 11,365 bp, 100 ng 690 1/2结论：克隆阳性率：克隆阳性率为50%。
转染染COS 细胞后，融合蛋白胞后，融合蛋白IL-2 signal- CD101-Fc表达情况良好表达情况良好8/17/202421[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®应用实例应用实例8/17/202422[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®应用实例应用实例------定点突变定点突变定点突变定点突变------完美实现单点多点突变完美实现单点多点突变实验流程流程1.确定突确定突变位点；位点；2.设计引物；引物；3.扩增目的片段及增目的片段及载体体线性化；性化；4.4.建立建立In-Fusion连接反接反应体系8/17/202423[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®应用实例应用实例------定点突变定点突变策略一5′ Sense Primer (Overlap with Vector Underlined, SpeI Site Bold)5′-GCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTG-3′Antisense Mutant Primer (Mutation Underlined)206-bp PCR Product5′-GAAGCGGATGAGTACAGACAGGGCAAAGTC-3′Sense Mutant Primer (Mutation Underlined)5′-TGTACTCATCCGCTTCTCACAACAGCAACAGC-3′3′ Antisense Primer (BspEI Site Bold)509-bp PCR product5′-TGTGGCTTCCTCCGGAAGGGTGCTTGGGGTTA-3′引物引物设计并并扩增目的片段增目的片段206-bp 和509-bp 将将human TIM-4 (hTIM-4)第第45位的色氨酸位的色氨酸（W或或Trp）突突变为丙氨丙氨酸（酸（A或或Ala），构建），构建hTIM-4 W45A 突突变体。
体8/17/202424[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®应用实例应用实例------定点突变定点突变建立建立In-Fusion连接反接反应体系（体系（ 10 μl ））6375-bp fragment containing the vector and 3′ end of hTIM-4206-bp PCR Product509-bp PCR product24 ng 1.6 ng 3.8 ng 结论：成功构建了：成功构建了5个个TIM-4 突突变体，体，经过测序序验证，其克隆阳性率，其克隆阳性率 分分别 为3/3、、3/3、、2/3、、2/3、、1/88/17/202425[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®应用实例应用实例------定点突变定点突变策略二4609-bp PCR ProductSense Mutant Primer (Mutation Underlined)5′-AGTTGAGCCCAAATCTTCCGACAAAACTCACACA-3′Antisense Primer5′-GATTTGGGCTCAACTTTCTTGTCCACCTTGGTGT-3′ 将人免疫球蛋白将人免疫球蛋白G1（（IgG1）第）第103位的半胱氨酸（位的半胱氨酸（C或或Cys）突）突变为丝氨酸（氨酸（S或或Ser），构建），构建IgG1 C103S突突变体。
体引物引物设计并并扩增目的片段增目的片段4609-bp结论：：经过测序序验证，克隆阳性率，克隆阳性率为33%33%In-Fusion连接反接反应体系（体系（ 10 μl ））4609-bp PCR Product20 ng 8/17/202426[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •主要内容主要内容 4In-Fusion®应用文献用文献 3In-Fusion®应用实例应用实例 1In-Fusion®技术原理技术原理 2In-Fusion®实验方法实验方法8/17/202427[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •In-Fusion®应用文献应用文献1.Comparative Epigenomic Analysis of Murine and Human Adipogenesis Tarjei S. Mikkelsen, Zhao Xu, et al. Cell, Oct 2010 ; 143 : 156–1692.In-Fusion BioBrick assembly and re-engineeringSean C. Sleight, Bryan A. Bartley, et al. Nucleic Acids Res., May 2010; 38: 2624 - 2636.3.Lumen Thiol Oxidoreductase1, a Disulfide Bond-Forming Catalyst, Is Required for the Assembly of Photosystem II in ArabidopsisMohamed Karamoko, Sara Cline, Kevin Redding, et al. PLANT CELL, Dec 2011; 23: 4462 - 4475.4.Ehrlichia chaffeensis TRP120 Interacts with a Diverse Array of Eukaryotic Proteins Involved in Transcription, Signaling, and Cytoskeleton OrganizationTian Luo, Jeeba A. Kuriakose, Bing Zhu, et al. Infect. Immun., Nov 2011; 79: 4382 - 4391.5.GMechanism of auxiliary β-subunit-mediated membrane targeting of L-type (CaV1.2) channelsKun Fang and Henry M. Colecraft. J. Physiol., Sep 2011; 589: 4437 - 4455.6.Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus-Encoded Ovarian Tumor Protease Activity Is Dispensable for Virus RNA Polymerase FunctionÉric Bergeron, César G. Albariño, et al. J. Virol., Jan 2010; 84: 216 - 226.7.CCS5, a Thioredoxin-like Protein Involved in the Assembly of Plastid c-Type CytochromesStéphane T. Gabilly, Beth Welty Dreyfuss, et al. J. Biol. Chem., Sep 2010; 285: 29738 - 29749.8.Major taste loss in carnivorous mammalsPeihua Jiang, Jesusa Josue, Xia Li, Dieter Glaser, et al. PNAS, Mar 2012; 10.1073/pnas.1118360109.8/17/202428[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •技术支持技术支持：：800-810-6261；； / 86：： ：： 我们将竭诚为您服务！我们将竭诚为您服务！8/17/202429[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 •Thank You ！3Q！！！！8/17/202430[医学]InFusion克隆技术介绍new克隆技术介绍 。