农杆菌感受态的制备与转化实验室根癌农杆菌感受态的制备：1. 取保存于-70°LBA4404菌株在YEB （含125Ag/ml链霉素或50mg/l 利福平）或平板活化，挑取单菌落接种于5mlYEB （含125Ag/ml链霉素或 50mg/l利福平）或YEP（含50mg/1利福平）液体培养基中，28°C、200rpm 培养 24-28h2. 取2ml菌液接种至50m1YEB （含125Ag/m1链霉素或50mg/1利福平） 或利福平）中，28°C、200rpm培养至OD6005.5左右3. 菌液冰浴30min后，4°C、8000rpm离心10min收集菌液4. 弃上清，用 10m10.15mo1/1Nac1 重悬菌体，4°C、8000rpm 离心 10min收集菌液5.弃上清，用2m120mmo1/1Cac12重悬菌体，加入1m160% 无菌甘油（使其终浓度为20%），每管100卩1分装，液氮冻存，-70°C保存重组质粒电转入农杆菌中：1.从大肠杆菌中提取重组质粒，将5u1重组质粒加入农杆菌感受态 中，至于冰上30min2.将混合物加入电击杯中，选择“Agr”模式（电 压2.2kv，时间4.9m）电击，加入800U1YEB 培养基，28°C、200rpm 振荡培养 3-5h，8000rpm 离心 30S （实际操作中不离心，吸取菌液50、100、150u1等多做几个梯度，用无 菌水稀释至180u1），弃上清，涂布于YEB平板（含农杆菌和质粒所带抗 生素，如Kan和利福平）°3.28°C恒温箱中倒置培养48h （24h以上）。
4.从农杆菌中提取质粒，双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测；扩目的片段 并测序验证5.转化烟草等实验材料YEB 培养基：1.0.5% (w/v)蔗糖，0.1% (w/v)细菌用酵母提取物，1% (w/v)细 菌用胰蛋白胨，0.05% (w/v)MgS04 ・7H20，调节pH7.0,121°C灭菌 15min2.固体加入1.5%的琼脂粉(100ml加1.5g)3.加所需抗生素，如Kan+，利福平，链霉素农杆菌感受态制备：1)活化原始农杆菌AGL-1菌株于YEB (含50Ag/ml羧苄青霉素)平 板上，28°C下倒置培养约2d； 2)从上述平板上挑单菌落于约5mlYEB液 体培养基内(含50Pg/ml羧苄青霉素)，于200rpm、28°C振荡培养过夜;3) 吸取1~2ml培养菌液接种到100mlYEB (含50Ag/ml羧苄青霉素)中，于 200rpm、28°C 摇床培养至 OD660Q0.5；4) 5000rpm，4°C下离心5min，去上清液，用20ml冰预冷的10% (v/v)甘油重悬菌体，此步骤重复两次；5) 5000rpm，4°C下离心5min，去上清液，用1 ml冰预冷的10% (v/v)甘油重悬，每管40M分装于1.5ml灭菌离心管中，液氮速冻后保存于 80°C 备用。
农杆菌电击转化：用电击法将载体质粒导入根癌农杆菌AGL-1的具体操作为：将5~50ng质粒DNA加入冰浴解冻的农杆菌感受态细胞中混匀，然后转入冰 预冷的电击杯中，将其置于电转化仪(Bio-Rad)中脉冲8~12m将电击 后的农杆菌转入 1mlYEB 中，于 28°C，200rpm 摇床培养 2~4hr 后， 5000rpm 离心 5min 收集菌体，弃大部分上清液，用余下液体重悬菌体， 混匀后涂布在含相应抗生素（如卡那霉素和羧苄青霉素）的 YEB 平板上 28°C 恒温箱中倒置培养 2d 左右至抗性菌落出现。