I N D E N T I F I C A T I o NO F ⅥR U SI N F E C T I N GS O Y B E A NA N DS E Q U E N C EA N A L Y S I SO FC PG E N E So FS E ⅦR A LS M VI S O L A T E SB yW a n gY uAT h e s i sS u b m i t t e dt oN a n j i n gA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yI nP a r t i a lF u l f i l l m e n to ft h eR e q u i r e m e n t sF o rM a s t e ro fD e g r e eS u p e r v i s e dA s s o c i a t e dP r o f ．Z h iH a i j i a nC o m p l e t e di nJ u n e2 0 11C o l l e g eo fA g r i c u l t u r eN n a j i n gA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yN a n j i n g ，2 1 0 0 9 5 ，P ．R ．C h i n aC o m p l e t e di nJ u n e2 0 11C o m m e n c e m e n ti nJ u n e2 011原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担学位论文作者( 需亲笔) 签名：王雨2 D 『『年占月3 0 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文保密口，在年解密后适用本授权书本学位论文属于不保密口 请在以上方框内打，，v ”)学位论文作者( 需亲笔) 签名：王雨导师( 需亲笔) 签名：l 布吲fz D f 『年舌月3 0 日劢} | 辱6 由c ＆目录目录摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IA B S T R A C T ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯ⅡI缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯V第一章文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11 植物病毒病及危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12 植物病毒的分类⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l3 植物病毒的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23 ．1 生物学检测法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23 ．2 电镜技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23 ．3 免疫学检测方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33 ．3 ．1 酶联免疫吸附法( E L I S A ) ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33 ．4 分子生物学方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53 ．4 ．1 核酸杂交技术( T e c h n i q u eo f n u c l e i ca c i dh y b r i d i z a t i o n ) ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．53 ．4 ．2 聚合酶链式反应( P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n , P C R ) 及相关技术⋯⋯⋯⋯．63 ．4 ．3 双链R N A ( D o u b l e ．s t r a n d e dR N A ，d s R N A ) 电泳技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。
94 植物病毒的发生与防治⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1 05 大豆花叶病毒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 05 ．1 大豆花叶病毒的发现⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1 05 ．2 大豆花叶病毒的基本性质和寄主范围⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 l5 ．3 大豆花叶病毒的症状表现及危害⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 15 ．4S M V 传播流行方式及影响因素⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 35 ．5S M V 的株系划分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 35 ．6S M V 基因组结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l85 ．7S M V 基因组编码的蛋白产物及其功能⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 95 ．8S M V 株系的基因组及C P 基因的序列同源性比较⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 06 研究的目的、内容及试验方案⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．2 36 ．1 研究目的和内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 36 ．2 试验方案⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。
2 4侵染大豆的病毒鉴定和部分S M V 分离物C P 基因的序列分析第二章杭州地区大豆花叶病毒的动态监测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．：! ! ；2 ．1 引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 52 ．2 材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 52 2 ．1 试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 52 ．2 ．2 试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 82 ．3 结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3 12 ．3 ．1 杭州地区大豆病毒病样的繁殖、血清学检测及生物纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 12 ．3 ．21 5 个分离物的血清学检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 22 ．3 ．3 杭州S M V1 2 个分离物在1 0 个鉴别寄主上的症状反应⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 22 ．4 结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 42 ．4 ．1结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 42 ．4 ．2 讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 5第三章安徽省和黑龙江省田间大豆病毒的检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。
3 73 ．1 引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 73 ．2 材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 73 ．2 ．1 试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 73 ．2 ．2 试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 83 ．3 结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一3 83 ．3 ．1安徽省田间大豆病毒的E L I S A 检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3 83 ．3 ．2 黑龙江省间大豆病毒的E L I S A 检测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3 93 ．4 结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 l3 ．4 ．1结j ' 沦⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 l3 ．4 ．2 讨j 沧⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 1第四章部分S M V 分离物C P 基因的克隆和序列分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 34 ．1 引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 34 ．2 材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 34 ．2 ．1 试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 34 ．2 ．2 试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 44 ．3 结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。
4 74 - 3 ．1总R N A 提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4 74 ．3 ．2R T ．P C R 扩增⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 7目录4 ．3 ．3S M V 及P o t y v i r u s 其它成员C P 基因核苷酸序列系统发育分析⋯⋯⋯⋯．4 84 ．4 结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5 14 ．5 讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5 1参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 3致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．6 1摘要侵染大豆的病毒鉴定和部分S M V 分离物C P 基因的序列分析摘要可以侵染大豆的病毒有许多种类，它们在各个大豆产区的组成和分布研究较少 而大豆花叶确S o y b e 孤M o s a i cV i r u s ，S M V ) 病是一种危害大豆的世界性病害，严重影响大豆的产量和品质S M V 存在株系分化，近年研究表明杭州地区的S M V 株系可能已经发生变异，与以往鉴定结果存在一定差异，本研究在杨清华( 2 0 0 9 ) 、李凯( 2 0 1 0 )等研究基础上采用同一套鉴别寄主体系，对采自杭州地区的病样进行株系的重新鉴定与动态监测，明确该地区的流行株系及变化趋势，以期为当地的大豆抗病育种提供技术支撑和指导；对采自安徽省和黑龙江省的病样针对1 2 种病毒( 大豆花叶病毒S M V 、苜蓿花叶病毒A M V 、花生矮化病毒P S V 、菜豆荚斑驳病毒B P M V 、菜豆黄花叶病毒B Y M V 、烟草环斑病毒T o R S V 、黄瓜花叶病毒C M V 、烟草花叶病毒T M V 、西瓜花叶病毒W M V 、蚕豆萎蔫病毒B B W V 、南方菜豆花叶病毒S B M V 、烟草坏死病毒Y N V )进行血清学检测，了解这2 个大豆产区的田问病毒种类弄口影响程度，为当地的大豆病毒病害防控和育种提供指导；对S M V 外壳蛋白( c P ) 基因进行序列分析，探索C P 基因的序列同源性与S M V 分离物的来源地及致病性反应之间的关系。
主要结果如下：1 ．将2 0 0 9 年采自杭州地区的4 1 个病样进行病毒的枯斑分离，共得到1 5 个纯化后的分离物，经血清学检测，呈S M V 阳性的有1 2 个，对其进行鉴别寄主反应鉴定和株系划分，其中分离物2 0 ．1 、2 ．4 、1 7 ．4 归为S C l 5 株系，其余均归为S C 9 株系，由此推测S C 9 和S C l 5 为杭州地区的优势株系2 ．对安徽省和黑龙江省的病样进行了血清学检测，发现两省均以S M V 阳性率最高，分别达1 9 ．7 1 ％和1 1 ．6 8 ％，可见S M V 是危害田间大豆的主要病害除S M V 之外、安徽省以P S V 、S B M V 这2 种病毒比率较高、分别。