六堡茶多酚氧化酶及其产生菌对茶叶品质的应用六堡茶是以梧州大叶毛茶为原料 , 按特定的初制和精制工艺进行加工 , 具有“六堡香”及红、浓、陈、醇等独特品质特征的黑茶发酵 ( 渥堆 ) 是六堡茶品质形成的关键 , 在高温、高湿度的条件下 , 微生物生长繁殖 , 以茶叶为底物发生如催化氧化茶多酚的系列反应目前 , 关于六堡茶多酚氧化酶及渥堆微生物的研究很少 , 本文将茶叶多酚氧化酶、茶叶理化成分变化及微生物数量联系起来 , 深入理解渥堆时期六堡茶品质形成的过程 ; 从六堡茶发酵样品中分离纯化得到多酚氧化酶同工酶 , 对其酶学特性进行研究 , 为后续酶促合成茶色素优化反应体系建立、酶固定化等领域提供理论指导 ; 除此之外 , 从六堡茶渥堆样品中分离鉴定出的产多酚氧化酶嗜热菌 , 被应用于茶叶固体发酵模拟实验 , 对比无菌、传统及单菌株发酵对茶叶成分的转化效果 , 进一步说明了六堡茶渥堆时期色、香、味等品质成分形成的机理本研究得到的实验结果如下 :1 、水浸出物是茶汤的主要呈味、呈色物质 , 它的含量与多酚氧化酶酶活高度正相关 (r=0.8776) 渥堆时期茶叶茶多酚含量从 16.6%降至 8.2%, 随着后期多酚氧化酶酶活升高 ,茶多酚下降速度加快 , 而游离氨基酸从 40.1mg/g 下降至 9.9mg/g 。
在六堡茶渥堆过程中 , 茶黄素和茶红素均呈现下降趋势 , 分别从 0.12%下降至 0.05%和从 5.24%下降至 0.74%,茶褐素从 2.53%上升至 5.77%, 分析出现这种变化的原因是多酚氧化酶酶活升高 , 催化了茶黄素、茶红素的进一步氧化另外 , 六堡茶渥堆过程中的多酚氧化酶酶活与霉菌的数量同样呈高度正相关(r=0.9192) 多酚氧化酶酶活总体呈上升趋势 , 但渥堆前毛茶的多酚氧化酶经过杀青工艺已经钝化或失活 , 推测新的多酚氧化酶可能是由微生物产生综上 , 多酚氧化酶对六堡茶品质形成起着重要作用 2、对六堡茶多酚氧化酶的提取进行优化 , 然后将渥堆前后两种茶样的粗酶液进行硫酸铵分级沉淀、选择合适的盐析饱和度、浓缩、经凝胶过滤层析将制得的样品进行 SDS-PAGE分析渥堆前毛茶 PPO分子量在 59kDa左右 , 而渥堆结束的茶叶样品出现了分别约为 59kDa和 70kDa的条带分析这是因为渥堆过程中微生物作用产生了新的 PPO,且该种 PPO可能是真菌产生的漆酶分子量为 70kDa 的 PPO1的最适 pH 值为 6.5 、最适温度 40℃、最适底物 ( 邻苯二酚 ) 浓度为 0.5mol/L 。
分子量为 59kDa的 PP02的最适 pH值为 6.0 、最适温度 35℃、最适底物 ( 邻苯二酚 ) 浓度为 0.5mol/L 3、利用传统培养法首次从渥堆茶样分离鉴定出嗜热菌 , 其中细菌 5 个属 ,14个种 ; 霉菌 5 个属 ,9 个种通过选择性培养基颜色变化和液态培养酶活测定筛选出三株产多酚氧化酶嗜热菌 , 分别为 Lichtheimia corymbifera( 伞状毛霉菌 ) 、Aspergillus tubingensis( 塔宾曲霉 ) 和 Aspergillus fumigatus( 烟曲霉 ) 此外 , 还通过液态发酵基础培养和茶汁培养绘制出目前课题组已从六堡茶中分离出的 5 种活性最强的多酚氧化酶产生菌的产酶曲线图 4、选择 Penicilliumgriseofulvum( 灰黄青霉 ) 、Aspergillus niger( 黑曲霉 ) 、 Aspergillusfumigatus( 烟曲霉 ) 进行茶叶固体发酵实验 , 对多酚氧化酶产生菌在茶叶生物转化效果的应用进行研究实验样品分为无菌、 传统和三种单菌株发酵组 , 对 40 天内它们的茶色素、 茶多酚及多酚氧化酶酶活变化进行测定。
从生长情况上看 , 黑曲霉、烟曲霉比灰黄青霉和未灭菌的毛茶微生物更能在高温高湿的固体茶叶环境下良好生长三种菌株发酵组的酶活均高于传统发酵和无菌发酵组 随着模拟发酵时间的增加 , 每组的茶多酚含量均出现不同程度的降低 , 其中烟曲霉发酵组对茶多酚的转化效果最为明显 , 传统发酵组次之各发酵组的茶黄素含量均随着时间的增长而下降 传统发酵组、 无菌组、灰黄青霉发酵组的茶红素、茶褐素呈现出明显的增长趋势而烟曲霉组和黑曲霉组的茶红素下降 , 茶褐素上升。