铜绿假单胞菌检验操作规程题目：铜绿假单胞菌检验操作规程编码：起草：日期：审核：日期：批准：日期：生效日期：颁发部门：质控部分发部门：检验室变更记载修改号变更原因及目的批准日期执行日期标准依据：中国药典2005版二部目的：建立一个铜绿假单胞菌检验的操作规程范围：本规程适用于铜绿假单胞菌的检验职责：检验者、质管部长对本规程的实施负责规程：1. 仪器、设备和用具1.1净化工作台1.2 恒温培养箱（36±1°C）1.3高压蒸汽灭菌器1.4 显微镜（1500 X）1.5微波炉或其他适宜加热装置1.6水浴箱45±1C1.7 离心机（500〜4000/min）1.8薄膜过滤装置微孔滤膜直径约50mm,孔径0.45±0.02um1.9 电冰箱1.10玻璃器皿：锥形瓶（250〜300ml）,培养皿（①90mm）, 量筒（100 ml）,试管（18X180mm）及塞，吸管（1ml分度 0.01, 10ml分度0.1）,载玻片，盖玻片1.11用具：大小橡皮头、无菌衣、帽、口罩、手套、酒精灯、酒精棉球、灭菌 剪刀、镊子、称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、陶瓦盖（①12cm）、不 锈钢盘（或陶瓷盘）2. 试液2.1消毒液2.1.1 0.1%苯扎溴铵溶液（供洗手、擦拭操作台面用）。
2.1.2 5%石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）亦可选用其他适宜消毒液2.1.3 75%乙醇溶液2.2稀释剂和试剂2.2.1PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液2.2.20.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液2.2.31%盐酸二甲基对苯二胺试液2.2.4盐酸试液2.2.5氯仿3. 培养基3.1营养肉汤培养基3.2胆盐乳糖（BL）培养基3.3营养琼脂培养基3.4溴代十六烷基三甲胺3.5绿脓菌素测定用培养基（PDP琼脂）3.6明胶培养基硝酸盐胨水培养基3.74. 对照用菌液铜绿假单胞菌［CMCC （B） 10104］营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36±1°C培养18〜24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1： 106,使对照菌加入量含菌10~100个（一般用量为0.1ml）,菌数在做阳性对照实验的同 时营养琼脂平板涂布经培养后计数确定5•操作方法5.1试验前的准备:5.1.1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至无菌室内每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量, 避免操作中出入操作间编号后将全部外包装（牛皮纸）去掉。
5.1.2开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作不低于30min5.1.3操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋再用 0.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手 套5.1.4操作前先用酒精棉球擦手，再用酒精棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开 口处周围，待干后用灭菌手术剪或镊将供试品启封5.2供试液的制备：5.2.1液体供试品 取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀，作为供试液油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均 匀，然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100m 1可溶性液体制剂可用混合 的供试品原液作为供试液5.2.2固体、半固体或黏稠液供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪（3000〜5000r/min、2〜4min）或其他有效的 方法，混匀，作为供试液必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加 温使供试品分散均匀5.2.3非水溶性供试品5.2.3.1软膏、乳膏剂 先将已备妥灭菌的含司盘80 5g、单硬脂酸甘油脂3g、聚山梨脂80 10g的混合物融化，待冷至45°C时，加入供试品5g （或5ml），立 即用玻棒搅拌均匀，分次少量慢慢加入45C的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1：20供试液。
5.2.3.2软膏、乳膏剂 取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯和 无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供 试品溶解然后加入45C的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,振摇5〜10分 钟，萃取，静置使油水明显分层，取其层作为1：10的供试液5.3具抑菌活性的供试品当供试品具有抑菌活性时，应消除供试液的抑菌活性后，再依法检查常用 的方法如下：5.3.1稀释法 取规定量的供试液，加至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用用平板法测定菌数时，1ml供试液可等量分 注多个平皿；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量培养基稀释法适用于抑菌 作用不强的制剂5.3.2离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，3000r/min，离心20min，弃 去上清液，留底部集菌液约2ml,加稀释剂至原规定量如供试液中有不溶颗粒、 沉淀，先以500r/min，离心5min，留离心沉淀物，取全部上清液按上述高速再离 心，留底部集菌液约2min，加稀释剂至原规定量5.3.3薄膜过滤法5.331取滤膜孔径不大于0.45pm,直径不小于50mm可拆卸的滤器。
根据供 试品及其溶剂的特性选择滤膜材质滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法进行灭 菌使用时，必须保证滤膜在过滤前后的完整性5.3.3.2水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜油类供试品， 其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供 试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗 滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，冲洗次数为3次每片滤膜的总过滤量不宜 过大，以避免滤膜上的微生物受损伤5.3.3.3每张滤膜取相当于1g或1ml供试品的供试液直接过滤，或加至适量稀 释剂中，混匀，过滤若供试品1g或1ml含菌较多，可选适宜稀释级的供试液1ml, 过滤用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，每张滤 膜每次冲洗量为100ml，冲洗次数为3次冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼 胆培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养每 种培养基至少制备一张滤膜滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡，否则影响微生 物生长5.3.3.4阴性对照试验 取试验用的稀释剂1ml同法操作，作为阴性对照阴性对照不得有菌生长。
5.3.3.5培养和计数 培养及菌落计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不多于100个如菌落数超过100个，不便计数时，可取高稀释级的供试液同法 操作，点计滤膜上的菌落数5.336菌数报告规则 以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告；若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤1g或1ml供试品），或＜1乘以稀释 倍数的值报告菌数5.3.4中和法 凡含汞、砷或防腐剂等的供试品，可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性，制成供试液5.4增菌培养：取胆盐乳糖培养基2瓶，每瓶100ml, 1瓶分别加入1： 10供试液10ml （相当 于供试品1g或lml）,另一瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照于36±1°C 培养18〜24h （必要时可延长至48h）,阴性对照菌应无菌生长5.5分离培养：轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取1〜2环培养液（如有菌膜应挑取之）， 划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于36±1C培养18〜24h铜绿假单胞菌 在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰 白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象菌落周围常有水溶性蓝绿 色素扩散，使培养基显蓝绿色，但亦有不产色素的菌株。
菌落还有粗糙型和粘液型 等，应注意挑选5.6纯培养：供试品分离平板生长5.4所述典型菌落或呈疑似菌落时，以接种针轻轻接触单 个 菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取2~3个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面， 培养，作以下检查5.6革兰染色镜检：5.6.1革兰染色（见SOP-QC-504-A 金黄色葡萄球菌检验操作规程5.6）5.6.2镜检铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽抱杆菌，单个，成对或成短链排 列5.7生化试验：5.7.1氧化酶试验 取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营 养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加1滴新配制的1%二盐酸二甲基对 苯二胺试液，在30s内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化 酶试验阳性反应若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应本试验应注意：1 ［试验菌落（苔）必须新鲜，陈旧培养物反应不可靠2 ）试验避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种针（环）（白金材料除外） 挑取菌落（苔）否则易出现假阳性宜用玻璃棒或木棒3） 试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用4） 反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气 隔绝，造成假阴性反应。
5） 麦康凯，SS琼脂培养基等含糖培养基上的菌落，不适于做氧化酶试验因 为糖分解产酸，抑制氧化酶活性5.7.2绿脓菌素试验取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基 (PDP)斜面上，36±1°C培养24h后，观察斜面有无色素，如有色素，在试管内 加氯仿3~5ml，以无菌玻棒搅碎培养基并充分振摇使培养物中的色素完全萃取在 氯仿液内静置片刻，待氯仿分层，用吸管将氯仿移至另一试管中，加入盐酸试液 (1mol/L)约1ml，振摇后静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色、即为阳性反应 如培养基斜面无色素产生，应于室温培养1~2天再按上法试验凡经再次检验，绿 脓菌素试验仍为阴性者应继续以下试验5.7.3硝酸盐还原产气试验以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种于硝 酸盐胨水培养基中，置36±1C培养24h后，观察结果如果在培养基内的小倒管 中有气体产生，即为阳性反应，表明该培养物能还原硝酸盐，并将来亚硝酸盐分解 产生氮气小倒管内无气泡者为阴性反应5.7.4 42C生长试验以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物于0.9%无菌氯 化 钠液中，制成菌悬液然后将菌悬液划线接种于营养琼脂斜面上，立即置41±1C 的恒温水浴箱内，务使整个斜面浸没在水浴中，培养24~48h，斜面如有菌苔生长 者为阳性反应；无菌苔生长为阴性反应。
5.7.5明胶液化试验以接种针沾取营养琼脂斜面培养物少许，穿刺接种于明 胶培养基中，穿刺深度应接近培养基的底部，于36±1C培养24h取出放入(0〜4C) 冰箱内10〜30mi n如培养基呈溶液状，即为明胶液化试验阳性反应；如明胶呈凝 固状，为阴性反应本试验应注意：1)本试验接种前，培养基应为固态，否则需将培养基置冰箱内使之凝固后， 再穿刺接种2［试验应同时设未接种细菌的阴性对照管，与试验管同时培养并观察结果6•结果报告6.1供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳 性者，即报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌6.2供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓菌素 试验阴性时，其硝酸盐还原产气试验、41C生长试验及明胶液化试验皆为阳性时， 亦报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌6.3凡与6.1与6.2结果不符时报告1。