实验实验一一 小麦小麦高分子量高分子量谷蛋白谷蛋白亚基亚基（（HMW-GSHMW-GS））的提取的提取 一、实验目的一、实验目的Ø了解了解小麦小麦HMW-GSHMW-GS提取提取及及SDS-PAGESDS-PAGE原原理Ø掌握小麦掌握小麦HMW-GSHMW-GS提取及提取及SDS-PAGESDS-PAGE方方法 小麦小麦HMW-GS变异类型变异类型图图1 1 以中国春（以中国春（CS））为为基准的各种小麦基准的各种小麦HMW-GSHMW-GS的的SDS-PAGE谱带谱带及及亚亚基的基的编编号（号（a、、b、、c、、d等）（等）（Payne lawrence,1983）） 二、实验原理二、实验原理Ø变性剂变性剂SDSSDS破坏蛋白质分子结构破坏蛋白质分子结构强还原剂巯基乙醇使半胱氨酸残强还原剂巯基乙醇使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，裂解后的基之间的二硫键断裂，裂解后的氨基酸侧链和氨基酸侧链和SDSSDS充分结合形成带充分结合形成带负电荷的蛋白质负电荷的蛋白质-SDS-SDS胶束胶束Ø蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束在水溶液中的形胶束在水溶液中的形状像一个长椭圆棒，椭圆棒的短状像一个长椭圆棒，椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基轴对不同的蛋白质亚基-SDS-SDS胶束胶束基本是相同的，但长轴的长度则基本是相同的，但长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比与亚基分子量的大小成正比。
Ø胶束在胶束在SDS-PAGESDS-PAGE中的电泳迁移率中的电泳迁移率主要取决于椭圆棒的长轴长度，主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小即蛋白质或亚基分子量的大小SDSSDS电泳不仅可以分离蛋白质，而电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率的大小测定蛋且可以根据迁移率的大小测定蛋白质亚基的分子量白质亚基的分子量图图1 蛋白质样品用蛋白质样品用SDS和还和还原剂处理后解聚成亚基原剂处理后解聚成亚基 不连续电泳包括两种不同孔径的凝胶：浓缩胶和分离胶不连续电泳包括两种不同孔径的凝胶：浓缩胶和分离胶浓缩胶：凝胶浓度较小，孔径相对较大，把较稀的样品加在浓缩胶：凝胶浓度较小，孔径相对较大，把较稀的样品加在浓浓缩胶上，经过较大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的缩胶上，经过较大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带，使样品组分在分离胶中得以高分辨率的分离区带，使样品组分在分离胶中得以高分辨率的分离分离胶：又称电泳胶，通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓分离胶：又称电泳胶，通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，使样品组分得以很好的分离分离胶又可为均一胶和梯度度，使样品组分得以很好的分离。
分离胶又可为均一胶和梯度胶本实验本实验用的是均一胶用的是均一胶二、实验原理二、实验原理图图2 SDS不连续电泳（分离胶为均匀胶）不连续电泳（分离胶为均匀胶） 1 1. . 实验仪器实验仪器 稳压稳稳压稳流流电电泳泳仪仪及配套及配套电电泳槽、泳槽、摇摇床、床、 台式离心机、微量移液器、台式离心机、微量移液器、 电电子天平子天平2 2. . 实验试剂实验试剂 样样品提取液、品提取液、1.5M Tris-HCl(pH8.8)溶液、溶液、0.5M Tris-HCl(pH6.8)溶液、溶液、30% Acr-0.8% Bis溶液溶液 、、10% SDS溶液、溶液、1.5% 过过硫酸硫酸铵铵溶液、溶液、 Tris-甘氨酸甘氨酸电电极极缓缓冲液、考冲液、考马马斯亮斯亮兰兰染色液染色液 三、实验仪器和实验试剂三、实验仪器和实验试剂 2. 实验试剂实验试剂1 1 样品提取母液样品提取母液: 6g SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)+37.5ml 0.5M Tris-HCl（（pH6.8）） +30.0mg溴酚兰溴酚兰+17.4ml蒸馏水蒸馏水+30ml甘油甘油2 样品提取液样品提取液: 27.2ml样品提取母液样品提取母液+ 4.8ml β-巯基乙醇巯基乙醇+64ml蒸馏水蒸馏水3 1.5M Tris-HCl(pH8.8)溶液溶液:18.17g Tris 溶于溶于40ml水中，加浓水中，加浓HCl调调pH至至8.8，定容到，定容到100ml4 0.5M Tris-HCl(pH6.8)溶液溶液:6.05g Tris溶于溶于40ml水中，加浓水中，加浓HCl调调pH 至至6.8，定容到，定容到100ml5 30% Acr(丙烯酰胺丙烯酰胺)-0.8% Bis(N, N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺)溶液溶液: 30gAcr+0.8gBis溶于溶于40ml水中，定容到水中，定容到100ml6 10% SDS溶液溶液:10g SDS加加40ml蒸馏水溶解，定容到蒸馏水溶解，定容到100ml7 1.5% 过硫酸铵（过硫酸铵（AP）溶液）溶液:0.15g AP溶于溶于10ml蒸馏水中，现用现配。
蒸馏水中，现用现配8 Tris-甘氨酸电极缓冲液甘氨酸电极缓冲液:3.032g Tris+1g SDS+14.4g甘氨酸甘氨酸,定至定至1000ml9 考马斯亮兰染色液考马斯亮兰染色液:250ml甲醇甲醇+100ml乙酸乙酸+0.6g考马斯亮兰考马斯亮兰+250ml蒸馏水蒸馏水10 脱色液脱色液:50ml甲醇甲醇+50ml乙酸乙酸+400ml蒸馏水；也可以直接用自来水作脱色液蒸馏水；也可以直接用自来水作脱色液 四、实验步骤四、实验步骤1.将小麦籽粒砸碎放入将小麦籽粒砸碎放入1.5ml离心管离心管2.加入加入400ul 50%异丙醇溶液，异丙醇溶液，60℃水浴水浴30min，其间摇，其间摇晃晃2次10000rpm离心离心3min，弃上清液，弃上清液3.重复以上步骤重复以上步骤2次次4.加入加入100ul提取液提取液B1（（50%异丙醇异丙醇+0.3%二硫代苏糖醇）二硫代苏糖醇），，60℃水浴水浴30min5.加入加入100ul提取液提取液B2（（50%异丙醇异丙醇+1.4%（（v/v））4-乙烯乙烯基吡啶），基吡啶），60℃水浴水浴1h，，10000rpm离心离心10min6.把把160ul上清液转移到新的离心管中，并在其中加上清液转移到新的离心管中，并在其中加600ul丙酮，放在丙酮，放在4℃1.5-2h7.10000rpm离心离心10min，弃上清液，在沉淀中加入，弃上清液，在沉淀中加入100ul样品提取液，放置样品提取液，放置2h以上，沉淀充分溶解后即可使用。
以上，沉淀充分溶解后即可使用 五五 制胶与电泳制胶与电泳（（1 1）取一套或两套干净的制胶专用玻璃板，在制胶架上）取一套或两套干净的制胶专用玻璃板，在制胶架上 固定好固定好（（2 2）先按照表）先按照表1 1的比例制好分离胶，摇匀后灌到玻璃板的比例制好分离胶，摇匀后灌到玻璃板 间，上端留间，上端留2.5cm2.5cm左右空间，加入蒸馏水；等待分离左右空间，加入蒸馏水；等待分离 胶凝结的时间里，按表胶凝结的时间里，按表2 2的比例制好浓缩胶预工作液的比例制好浓缩胶预工作液 （加入前四项）（加入前四项）表表1 分离胶工作液的配制分离胶工作液的配制表表2 浓缩浓缩胶工作液的配制胶工作液的配制 五五 制胶与电泳制胶与电泳（（3 3）分离胶凝结后胶面与水面之间会出现清晰的界面，此）分离胶凝结后胶面与水面之间会出现清晰的界面，此 时将水倒出来，用滤纸把剩余的水吸干；在浓缩胶预时将水倒出来，用滤纸把剩余的水吸干；在浓缩胶预 工作液中加入表工作液中加入表2 2中要求的中要求的1.5% AP1.5% AP及及TEMEDTEMED，混匀后，混匀后 灌进玻璃板内，迅速插入样梳灌进玻璃板内，迅速插入样梳（（4 4）浓缩胶凝固后将其从制胶架上取下来，拔出样梳，用）浓缩胶凝固后将其从制胶架上取下来，拔出样梳，用 蒸馏水水将点样孔冲干净；将胶板夹在电泳槽上，在蒸馏水水将点样孔冲干净；将胶板夹在电泳槽上，在 电泳槽的倒入电极缓冲液，上样量为电泳槽的倒入电极缓冲液，上样量为4ul4ul（（5 5）接通电源，每板胶稳流）接通电源，每板胶稳流12-15mA12-15mA，指示剂出胶后再跑，指示剂出胶后再跑2 2 h h，停止电泳；，停止电泳；（（6 6）揭开玻璃板，切下浓缩胶，将分离胶放到染色液内，）揭开玻璃板，切下浓缩胶，将分离胶放到染色液内， 染色染色15-3015-30分钟（视染色液新旧而定）；然后用脱色分钟（视染色液新旧而定）；然后用脱色 液或水脱色至背景清晰。
液或水脱色至背景清晰 51021217187912*13168六六 实验结果实验结果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 。