gateway克隆技术2006-12-13 17:11:30|分类：工作|标签：|字号大中小订阅一种更好的克隆方法Gateway™技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤, 而同时典型的克隆效率高达95％或更高当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框Gateway™也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达Gateway™利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多 次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway™改造过的的各种表达载体（目的载体）此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心在使用每一种新的表达系统时，将 会节省您更多的时间图1-Gateway™技术的灵活性*目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体一种强大而可靠的技术Gateway™技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达一旦进入这个多功能的操作系统， DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway™技术是基于已研究的非常清楚的入嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP —attL x attR）°BP和LR两个反应就构成了 Gateway™ 技术（表1和图2）BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆LR反应是 一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体Gateway™技术也利用了 ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆典型的效率是595%需要了解更多的有关ccdB的信息，请参考 ^术］表/ |、心 O表 1 - 反应和术语总结反应反应位点产物产物结构BP反应attB x attP入门克隆attL1-基因-attL2LR反应attL x attR表达克隆attB1-基因-attB2完成构建Gateway™表达克隆仅需两步（图2 ）：1•创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体2•混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway™ LR Clonase™酶，产生表达克隆表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。
在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆可以通过以下几种方法构建Gateway™入门载体无论您选择何种方 图3-Gateway™定向TOPO®克隆法，创建的入门载体都是用来与各种目的载体进行重组PCR克隆（定向TOPO®克隆至入门载体或与供载体BxP重组）•限制性内切酶消化和连接进入入门载体•使用 pCMV・SPORT6 或 PEXP-AD502*构建 Gateway™兼容 cDNA文库• Gateway™改造过的克隆资源*（*这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点这些克隆可以通过与供载体及BP Clonase™酶反应转换到入门载体请登录获得已有克隆资源的更多信息PCR-定向（PCR-Directional）TOPO®克隆定向TOPO®克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效进行5分钟的简单连接，产生＞90%的重组子您不仅会比用 连接酶介导的方法更快的获得克隆，而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间定向TOPO®克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR产物到入门载体平端PCR产物定向克隆的效率〉90%，从而简化了筛选。
同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或限制性内切酶目前有两种定向TOPO®克隆载体:pENTR/D-TOPO®和 pENTR/SD/D-TOPO® （表2和图3）,它们具有有以下特点：•位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway™目 的载体进行有效重组• 通用 M13 位点便于测序• 基于 pUC 的 ori 位点提供高产量质粒•大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选表2-两种pENTR/D-TOPO®载体的简单比较入门载体特点优点pENTR/D-TOPO®无 SD (Shine-Dalgarno)位点真核细胞中天然、N-或C-端融合；大肠杆菌中N-端融合；如果基因包含有SD序 列，可在大肠杆菌中进行C-端或天然蛋白表达pENTR/SD/ D-TOPO®含 SD (Shine-Dalgarno)位点包含基因10和一个SD序列，可以有效的启动天然蛋白和融合蛋白在大肠杆菌中的表达构建入门载体的各种选择A限制性内切酶消化作为PCR克隆的替代方法，有5种Gateway™入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆这些载体配合合 适的目的载体，可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。
为了在真核细胞中有效地翻译蛋白，所有的5 个Gateway™入门载体提供了 Kozak序列此外，pENTR™11提供了 SD （Shine-Dalgarno）序列，便于在大肠杆菌中有效的 翻译B PCR重组克隆重组是从PCR产物创建Gateway™入门克隆的另一种方法这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵 育扩增PCR产物和pDONRTM载体（包含attP位点）及Gateway™ BP ClonaseTM酶混合物接着转化进大肠杆菌中，您将会 获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点这个入门克隆可以与任何Gateway™目的载体进行重组 （参看图2 ）C Gateway™改造过的cDNA文库如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库，您就可以通过pDONRTM载体和BP ClonaseTM酶混合物进行一个 简单的重组反应，很容易地把单个克隆转换成Gateway™入门克隆这样就不再需要亚克隆和测序，为您节约数小时的时间SuperScript cDNA文库使用pCMV・SPORT （登录获得更多信息）构建，有几种的人组织来源可供选择， 这些文库有很大一部分是全长的插入片段，可以完全代表来源mRNA。
如要了解Gateway兼容文库的详细列表，请登录 特殊的高级cDNA文库构建技术，oligo dT引物，以及SuperScriptTM II反转录酶所构建的文库许多克隆来源于I.MAG.E. 协会，NCI CGAP 项目，ResGenTM库或 UltimateORF库克隆资源因为已克隆到Gateway改造过的载体，所以可以快速地将基因转到各种表达系统中图4-进入Gateway™系统的各种路线*目前的克隆资源带有attB位点，需要与pDONR质粒重组触手可及的最高级表达系统一旦您构建好Gateway™入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会向您敞开使用Gateway™技术，您可以进入到几乎是无数种的表达系统因为没有一个单一的表达系统蛋白适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白(图5)为了扩展表达的选择，Invitrogen已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系统中无论您选择哪个系 体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物一一都可以获得Gateway™目的载体此外，你可以很容易地把你自己最喜欢的表达载体转换成Gateway™目的载体图5-在Gateway™系统表达全长开放阅读框大肠杆菌GUS基因、人类MAP4和Eif-4E基因平行转移进目的载体，在Sf9昆虫细胞(杆状病毒)或大肠杆菌BL21-SITM菌株表达天然蛋白、N-端His或N-端GST融合蛋白。
在所有的系统中均观察到GUS良好的表达，而MAP4只在昆虫细胞中表达，Eif-4E只在大肠杆菌中表达在Hartley, J.L. et al. (2000) GenomeResearch 10(11):1788-95 可以找到更多的细节表3-Gateway™技术入门选择进入 Gateway™使用PCR和BP重组使用限制性内切酶和超螺旋载体12535019Gateway™和 pDONR™221PCR 克隆系统11813011pENTR™1A入门载体12536017卡那霉素抗性pDONR™22111816014pENTR™2B入门载体12213013庆大霉素抗性pDONR™20711817012pENTR™3C入门载体使用TOPO®克隆11818010pENTR™4入门载体K240020pENTR/D-TOPO® Cloning Kit11819018pENTR™11入门载体K2400480HTP pENTR/D-TOPO® Cloning KitGateway™酶混合物K2400500HTP pENTR/D-TOPO® Cloning Kit11789013Gateway™ BP Clonase™ 酶混合物K242020pENTR/SD/D-TOPO® Cloning Kit11791019Gateway™ LR Clonase™ 酶混合物K2420480HTP pENTR/SD/D-TOPO® Cloning Kit12538013Gateway™ LR Clonase™Plus 酶混合物K2420500HTP pENTR/SD/D-TOPO® Cloning Kit体外表达Expressway in vitro蛋白合成系统简化当前市场上的体外（无细胞）表达系统。
仅需两小时，您就可以在一个反应管中获得高达 50pg的表达蛋白，而无须传统细胞表达体系的烦琐和花费仅需加入优化构建的超螺旋或线性DNA模板到Expressway反应 管，DNA模板由T7启动子驱动每一个反应管中包括大肠杆菌（E.coli）抽提物（可以同时进行转录和翻译）和强大的ATP 能量更新系统（保证连续高水平活跃蛋白表达的能量水平要求）Gateway™技术为进行基因功能分析和蛋白表达提供了广泛深入的方法您可以通过把目的基因转移到优化构建的体外表达载 体，pEXP1-DEST或pEXP2-DEST （表4）（包括在系统中），然后开始体外蛋白合成pEXP1-DEST或pEXP2-DEST载 体中的T7启动子，核糖体结合位点（RBS）（仅pEXP1-DEST）以及T7终止子之间的间隔的序列搭配都为Expressway的蛋白 表达专门优化（图6）,从而用Expressway进行蛋白表达转移的基因定向、阅读框正确，并随时可以用于表达图 6 pEXP1-DESTTM 和 pEXP2-DESTTM载体表4-Gateway™体外蛋白合成目的载体产品目录号组成描述pEXP1-DEST™V960-01N-端6xHis，具有EK裂解酶识别位点的XpressTM表位•体外表达最佳配置•T7启动子产生重组蛋白。