真菌真菌镜检染色-乳酸棉兰酚染色天津市第三中心医院检验科张健东 1.真菌标本的接种2.培养基选择3.常用染色方法4.曲霉菌属镜下形态和菌落特点5.病例分析 医学重要的霉菌分类医学重要的霉菌分类 合格痰标本分类细胞数/低倍视野WBC扁平上皮细胞5>25<104>2510-25•含1-2种不同细菌，可考虑继续培养，结果可根据病情再作分析•超过3种细菌，按不合格标本处理中华检验医学杂志,2000,23(5):312 真菌标本的接种呼吸道呼吸道标本标本,肺泡灌洗液肺泡灌洗液无菌体液：无菌体液： （脑脊液、（脑脊液、穿刺液、骨髓、玻璃体等）穿刺液、骨髓、玻璃体等）无菌体液无菌体液1-5ml打入打入真菌真菌/分枝杆菌血培养瓶分枝杆菌血培养瓶三区划线三区划线28℃℃孵箱，孵箱，5天天培养基用培养基用封口膜封口膜密封密封好好怀疑生长怀疑生长缓慢菌缓慢菌（如组织胞浆菌）（如组织胞浆菌），延长培养时间，延长培养时间至至30天怀疑真菌怀疑真菌生长生长，，点种点种真菌培养真菌培养宜使用含和不含抗菌药物的两类培养基。
经空气传播有高度感染性的真菌样品、含菌丝体的真菌应在生物安全柜内处理若采用平皿培养，应封盖CNAS-CL42：：2012 培养基选择沙保罗培养基SDA马铃薯培养基PDACHROMagar念珠菌显色培养基 •菌落形菌落形态态（（菌落大小、形态、色素、颜色和质地）•显显微微镜镜下下真菌真菌孢孢子、菌子、菌丝丝、、产孢产孢等特征性等特征性结结构构进进行行初步判断真菌种属初步判断真菌种属•遇到遇到疑疑难的的丝状真菌，状真菌，应请专业组内多名技内多名技术人人员观看、看、讨论，以确定种属以确定种属•每次每次观察的菌落特征均需要察的菌落特征均需要记录、并照下、并照下显微微镜下下的形的形态特征和菌落特征和菌落•参考参考图谱或网上咨或网上咨询真菌培养物形真菌培养物形态态学学鉴鉴定定 菌落形菌落形态态 观观察察•酵母型菌落•类酵母型菌落•丝状型菌落（正、反）•双相真菌显显微微镜检查镜检查•有隔或无隔•分支或不分支•有色或无色形形态态学学鉴鉴定定 常见显微镜检查方法常见显微镜检查方法•KOH压片法（直接镜检）•墨汁染色•乳酸酚棉兰染色•六胺银染色•革兰染色： 回顾性看有利于诊断 显微镜检查方法显微镜检查方法•KOH压片：皮屑、毛发、指甲、脓液、痰等标本置于载玻片上，加一滴10-20% KOH，盖上盖玻片镜检，加热30-60s，镜检先低倍后高倍（在KOH中加入刚果红1:1，更有利于真菌检测） •墨汁染色：以无菌吸管吸取处理过的标本一滴置于玻片上，再加上一小滴印度墨汁混合均匀，以40°角盖上盖玻片(避免产生气泡)镜检（样本与墨汁等量混合）显微镜检查方法显微镜检查方法 显微镜检查方法显微镜检查方法•乳酸酚棉兰染色：通常采用透明胶带法–利用胶带先粘一定量菌丝–再粘在预先滴加乳酸酚棉兰的载玻片上–显微镜下观察孢子和菌丝的形态、特征、大小和排列等。
•六胺银染色–涂片（痰需消化，无菌液体离心）甲醇固定后自然风干–过碘酸滴染10分钟，溶液用后弃去–流水冲洗（3遍）–65℃银溶染液1h-1.5h染色时间根据涂片的厚度所怀疑真菌的种类，通常念珠菌染色1h即可，疑为曲霉或者其他丝状真菌须适当延长染色时间（银溶液需现用现配，只用一次）–流水冲洗（3遍）–0.25%的氯化金染1到2分钟（可重复使用）–流水冲洗–3%的硫代硫酸钠染1分钟–流水冲洗–0.1%的亮绿染色30秒到1分钟 目的使得到一个背景色显微镜检查方法显微镜检查方法菌体的包囊壁呈黑色 曲霉菌镜下形态特点•菌丝体形态–曲霉菌丝有隔膜，为多细胞霉菌–分枝 （ 45℃角）–有分枝足细胞•分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，一般呈球形 烟曲霉菌落特点培养特性：1.生长快2.45℃仍可生长3.开始为白色4.2-3日后转为蓝绿色5.背面无色或黄褐色6.表面粉末状烟曲霉菌落, PDA, 25℃, 7d 镜下形态•分生孢子头短粗型，梗光滑，4/5小梗覆盖，倒立烧瓶状顶囊，顶囊有单层小梗•小分生孢子呈球形，绿色，有小刺 镜下形态镜下形态足细胞顶囊 18鉴别要点•45℃生长良好，菌落呈蓝绿色•顶囊呈烧瓶状，小梗为单层，与双层的土曲霉，杂色曲霉，构巢曲霉相区别•顶囊单层和双层两种瓶梗的黄曲霉和黑曲霉鉴别，蓝绿色可与绿曲霉和棒曲霉鉴别 形态学观察 黄曲霉菌落特征－生长快－孢子黄色－表面粉末状 黑曲霉菌落特征1.生长快 2.PDA培养基菌落初为白色继而黑色3.背面无色或中央略褐色4.厚绒状5.气生菌丝多 镜下形态•分生孢子头疏松放射状，梗无色，小梗为单层，双层，或单双层同时生于一个顶囊，成放射状•小分生孢子呈球形或梨形，表面粗糙 镜下形态镜下形态分生孢子*400分生孢子*1000 鉴别要点•顶囊有单层和双层瓶梗，可与烟曲霉，土曲霉以及杂色曲霉和构巢曲霉相鉴别。
•分生孢子梗光滑，无色至褐色，菌落初为白继而黑色，可与黄曲霉鉴别 形态学观察形态学观察• 土曲霉菌落特征－生长快－菌落圆形－孢子淡棕色或棕色 形态学观察形态学观察•构巢曲霉–绿色，浅黄到黄色（正面）–紫红色到橄榄色（背面）–顶囊（半球形或烧瓶状）–小梗 双层，第一层略长–孢子 (球形，粗糙，成链排列) 形态学观察形态学观察•杂色曲霉菌落特征–菌落生长慢–紧密、圆形–绒毛状到羊毛状–颜色数种，从青绿到红绿 曲霉菌形态特点曲霉菌菌落颜色分生孢子头分生孢子梗瓶梗正面反面烟曲霉灰绿、蓝绿浅黄柱状滑壁，无色或绿色单层黄曲霉黄-绿黄,褐放射状，成熟变柱状粗糙、无色单层、双层黑曲霉黑白,浅黄放射状，成熟变疏松滑壁，无色或棕色单层、双层土曲霉棕,肉桂浅黄、棕色柱状滑壁,无色双层构巢曲霉绿、浅黄浅紫、红,橄榄色短柱状滑壁，棕色双层杂色曲霉白、浅黄、黄、粉黄、灰白、绿白,黄,浅紫、红放射状滑壁,无色双层 青霉属培养特性1.橘青霉PDA培养基上25-28℃生长较快，菌落表面呈绒状，少数为絮状，表面为蓝色或灰绿色，背面黄色至橙色2.绳状青霉表面白色至粉色，有时有蓝绿色区域3.马尔尼菲青霉初为灰白色蜡样，膜状平坦菌落，逐渐变成淡黄，黄绿色，背面红色2周左右表面呈淡红色绒毛状，整个培养基被染成玫瑰红色 菌落特点菌落特点 镜下形态分生孢子梗大多从基质长出，或气生菌丝生长，每个梗基上簇生6-10个平行而略密的小梗，形成特征性的帚状枝。
临床意义临床意义•橘青霉可引起肾脏的损害，有弱致癌性；•绳状青霉可引起大米变质并引起中毒；•马尔尼菲青霉引起皮肤结节，皮下脓肿及网状内皮系统感染，预后凶险 链格孢属培养特性SDA培养基上28℃培养，生长迅速，形成棉絮状，后变为绿褐色至深褐色，背面为黑色 镜下形态——分生孢子梗直立，暗色，分隔，单生或分枝状分生孢子砖格状，倒棍棒状，有尖，光滑或粗糙，水平，垂直，或斜形分隔 临床意义临床意义•链格孢可引起皮下组织脓肿和溃疡，还可引起足菌肿 病例分析病例分析•现病史•女，78岁，天津东丽区人，患者因反复咳嗽咳痰、憋喘十余年加重5天、神志不清1天入院入院5天前出现咳嗽咳痰加重，痰液呈黄粘状不易咳出，于当地卫生院就诊，给予平喘消炎治疗（消炎药未知）未见好转，喘息加重1天前神志不清，我院急诊查血气，显示II型呼衰，进行器官插管，收入ICU 病例分析病例分析•既往史•长期吸烟史、糖尿病史、高血压史，长期使用“野药”（可疑激素）史 病例分析病例分析•入院检查•体温37.2℃，昏迷、对光反射消失，双肺呼吸音粗，可闻及干湿性罗音，心率24BPM，血压无法测出；•白细胞12.42*109/L，PCT7.66ng/ml，微生物动态真菌监测41.45ng/ml。
肺炎支原体培养阳性，痰培养为多重耐药鲍曼不动杆菌•肺CT提示：双肺下叶炎性病变，考虑右肺中叶膨胀不全，双肺间质性改变，双肺肺气肿，双肺索条状及钙化点 病例分析病例分析 病例分析病例分析•治疗及转归•给予阿奇霉素和舒普深治疗，同时使用甲强龙扩张气道平喘，不排除肺真菌感染的可能性，继续行痰培养和真菌培养检查•3月27日真菌培养结果为烟曲霉，加伏立康唑治疗•3月30日，患者气道痉挛较前好转，喘憋减轻•3月31日，PCT 1.03ng/ml，患者气道痉挛明显好转，喘憋减轻，适当下调呼吸机条件，双肺呼吸音低，可闻少量湿罗音 病例分析病例分析培养基镜下形态 病例分析病例分析•治疗及转归•4月12日，脱机；•4月17日，两次痰真菌培养阴性，微生物动态真菌监测阴性，伏立康唑用足疗程，决定停药；•4月22日，脱机9日，患者COPD，但不能脱离无创机械通气辅助，提示预后不良，家属拒绝再次插管；•4月25日，患者自动出院 病例分析病例分析WBCNEUHGBPCTG试验3.2312.4284.4%997.6641.453.2611.1493.7%1068.33125.304.79.8185.9%910.53103.404.1210.1685.8%761.29＜10 病例分析病例分析•分析•患者入院痰培养提示多重耐药鲍曼不动杆菌，给予舒普深治疗；•后真菌培养提示烟曲霉感染，给予伏立康唑治疗后，病人病情明显好转；•继续行痰培养和真菌培养检测，痰培养依旧提示鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌；•考虑应用舒普深导致肠道菌群失调逆行入患者气道内所产生的感染，并非患者侵袭性肺病的根本病原菌。
病例分析二病例分析二•现病史–女，65岁，河北省定州市人，入院前一周感咳嗽，为黄色黏痰，伴憋气，伴双下肢水肿，伴皮肤黏膜黄染加重，伴尿色加深，于2015年5月13日收入我院肝内病区•既往史–患者自身免疫性肝硬化病史，曾行食道静脉曲张套扎治疗，低蛋白血症，胆红素明显增高，肝功能储备差，应用激素治疗•入院检查–肝病面容，皮肤巩膜重度黄染，体温36.0℃，白细胞9.16*109/L ，中性粒细胞百分比92.0%，HB 105g/L，PCT 0.35ng/ml 病例分析病例分析•治治疗与与转归•5月14日，体温37℃，咳嗽咳痰，行痰培养检查；•5月15日，胸片提示：双下肺纹理增粗；患者长期服用激素，免疫力低下，易合并感染，考虑肺炎，给予拜福乐抗感染治疗；•5月20日，患者体温38.2℃，咳嗽、咳痰、痰中带血，CT提示双肺多发结节影及团片状致密影 病例分析病例分析•5月21日，送检痰培养；•5月22日，痰培养回报怀疑曲霉菌感染，遂请呼吸科会诊，不排除曲霉菌感染，送检痰真菌培养，并加用伏立康唑•5月25日，葡聚糖105.70pg/ml，白细胞5.18*109/L，痰真菌培养提示烟曲霉 病例分析病例分析5月20日5月21日5月22日5月23日5月24日5月25日5月26日5月27日5月28日5月29日5月30日5月31日6月1日6月2日050100150200250300350G试验G试验5月20日5月21日5月22日5月23日5月24日5月25日5月26日5月27日5月28日5月29日5月30日5月31日6月1日6月2日00.20.40.60.811.21.41.61.8GM试验GM试验 病例分析病例分析5月20日5月21日5月22日5月23日5月24日5月25日5月26日5月27日5月28日5月29日5月30日5月31日6月1日6月2日024681012白细胞白细胞 病例分析病例分析莫西沙星抗感染胸CT提示双肺多发结节影及团片状致密影痰培养疑似曲霉菌感染呼吸科会诊伏立康唑真菌培养提示烟曲霉感染胸CT提示炎症吸收消散偶有咳嗽胸CT提示炎性病变治疗后改变 病例分析病例分析•5月27日，患者咳嗽咳痰较前好转，无痰中带血，体温正常。
•5月28日，复查胸CT，双肺多发结节影及团片状致密影，较前吸收消散、数量减少•6月2日，患者偶有咳嗽，咳痰较前明显减少；•6月4日，胸CT提示双肺多发空洞样病变，考虑炎性病变治疗后改变，患者出院 谢谢 谢谢 聆聆 听听! 。