血清蛋白质醋酸纤维素薄膜血清蛋白质醋酸纤维素薄膜电泳电泳 实验目的•掌握电泳的根本原理，了解电泳仪、电泳槽的根本构造与功能•熟习电泳的根本过程与定量方法•熟习血清电泳在临床诊断的作用 实验原理•—PH＜PI时，蛋白质带正电荷，移向负极•PH＝PI时，蛋白质不带电荷•PH＞PI时，蛋白质带负电荷，移向正极•迁移率：是指单位电场强度是离子运动的速度，也称电泳度•醋酸纤维素薄膜电泳：以醋酸纤维素薄膜为支持物的电泳醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成将醋酸纤维素溶于丙酮等有机溶液中，可涂布构成均一细密的微孔薄膜，厚度约0.1~0.15mm •血清中各种蛋白质的等电点不同，在同一高于其等电点的PH值缓冲液中，他们都带负电荷，但电荷数量不同同时，各种蛋白质的分子大小不一，所以在同一电场的电泳迁移率不同在醋酸纤维素膜上可分为五条区带电泳迁移率最大的是白蛋白，其后依次为α1、 α2、 β和 γ 球蛋白染色后经透明处置可直接在光密度计上扫描定量 实验器材与试剂•器材器材•电泳槽、电泳仪、脱色摇床、染电泳槽、电泳仪、脱色摇床、染缸、滤纸、醋酸纤维素薄膜、点缸、滤纸、醋酸纤维素薄膜、点样器样器 • DYY-5型稳压稳流电泳仪型稳压稳流电泳仪 DYY-3型电泳箱型电泳箱 试剂：电极缓冲液：巴比妥缓冲液〔PH8.5~8.7、I=0.06〕:称取巴比妥2.21g、巴比妥钠12.36g于500ml蒸馏水中，加热溶解，待冷却至室温后，用蒸馏水补足至1L。
染色液：氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B0.1g，溶于无水乙醇20ml中，加冰醋酸5ml、甘油0.5ml，使溶解，然后将磺柳酸2.5g溶于少量蒸馏水中，参与前液，再以蒸馏水补足至100ml 续：试剂漂洗液：甲醇45ml、冰醋酸5ml和蒸馏水50ml，混匀适用于氨基黑10B染色的漂洗透明液：称取柠檬酸21g和N-甲基-2-吡咯烷酮150g，以蒸馏水溶解，并稀释至50ml亦可选用十氢萘或液体石蜡透明〔注明各试剂的作用) 实验操作1.预备：将巴比妥缓冲液参与电泳槽的电极室内，预备：将巴比妥缓冲液参与电泳槽的电极室内，是正负极室的吖液面等高，电泳支架宽度正好是正负极室的吖液面等高，电泳支架宽度正好适宜醋纤薄膜的长度，用四层纱布或滤纸做盐适宜醋纤薄膜的长度，用四层纱布或滤纸做盐桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上桥，一端浸入缓冲液中，一端搭在支架上2.浸膜：先于膜条无光泽面距一端浸膜：先于膜条无光泽面距一端1.5cm处用铅笔处用铅笔轻划不断线〔点样线〕，再将薄膜无光泽面向轻划不断线〔点样线〕，再将薄膜无光泽面向下浸泡于巴比妥缓冲液中，浸透为止〔约下浸泡于巴比妥缓冲液中，浸透为止〔约10~20min〕。
当膜条无可见的白斑或点状的不〕当膜条无可见的白斑或点状的不透明区时，取出，将薄膜无光泽面向上，平放透明区时，取出，将薄膜无光泽面向上，平放于干净滤纸，薄膜上再放一张干净滤纸悄然吸于干净滤纸，薄膜上再放一张干净滤纸悄然吸去多余的缓冲液去多余的缓冲液 3.点样点样:用滴管汲取待测血清一滴于玻璃片上，用点用滴管汲取待测血清一滴于玻璃片上，用点样器或宽样器或宽1.5cm的的X光软片末端处蘸取少许样品，光软片末端处蘸取少许样品，垂直轻印〔迅速均匀〕到薄膜点样线上，使血清垂直轻印〔迅速均匀〕到薄膜点样线上，使血清完全浸透到薄膜内，构成一定宽度、粗徐均匀的完全浸透到薄膜内，构成一定宽度、粗徐均匀的直线〔注：点样量不宜过多！〕直线〔注：点样量不宜过多！〕4. 这是关键步骤，印章法加样时，动作应这是关键步骤，印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄破或印出凹陷而影响电泳区带分别效果点样前可先在滤凹陷而影响电泳区带分别效果点样前可先在滤纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样纸上反复练习，掌握点样技术后再正式点样 4.平衡：将膜条无光泽面向下置于电泳槽支架上，平衡：将膜条无光泽面向下置于电泳槽支架上，点样端接近负极，薄膜两端要紧贴纱布或滤纸，点样端接近负极，薄膜两端要紧贴纱布或滤纸，中间平直悬空，加盖密封，平衡中间平直悬空，加盖密封，平衡5分钟。
分钟5.电泳：将电泳槽正负极与电源正负极接好开启电泳：将电泳槽正负极与电源正负极接好开启电源，调理电流密度为电源，调理电流密度为0.5mA/cm,如有如有10条宽条宽2cm的膜条，其总宽度为的膜条，其总宽度为20cm,应运用电流强度应运用电流强度为为20cm*0.5mA/cm=10mA电压15V/cm通电50分钟左右，使电泳区带展开分钟左右，使电泳区带展开3~3.5cm封锁电源6.染色：取下薄膜直接浸于氨基黑染色：取下薄膜直接浸于氨基黑10B染色液中，染色液中，染色染色5~10min〔以蛋白带染透为止〕，然后在漂〔以蛋白带染透为止〕，然后在漂洗液中漂去剩余染料，直至背景无色为止漂洗洗液中漂去剩余染料，直至背景无色为止漂洗液可回收液可回收 7.定量〔光密度计扫描法〕定量〔光密度计扫描法〕①透明：汲取薄膜上的漂洗液〔以防止透明液被稀释影响透明结果〕，将薄膜浸入透明液中2~3分钟〔延伸一些时间亦无碍〕取出，以滚动方式平贴于干净无划痕的载玻片上〔勿产生气泡〕将此玻璃片树立片刻，除去一定量透明液后，置已恒温90~100°C烘箱内烘烤10~15min，取出冷至室温② 用此法透明的各蛋白质区带鲜明，薄膜平整，可供直接扫描和永久保管〔假设用十氢萘或液体石蜡透明，应将漂洗过的薄膜烘干后进展透明，此法透明的薄膜不能久藏，且易发生皱折〕。
③扫描定量：将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其他光密度计暗箱内，进展扫描分析 •计算公式：•各组分蛋白质%=Ax/At*100• 〔 Ax:各组分蛋白质的吸光度• At:各组分蛋白质吸光度的总合〕•各组分蛋白质的绝对浓度〔g/L〕＝血清总蛋白〔g/L〕*各组分蛋白质的百分浓度〔％〕 本卷须知:•每次电泳时应交换电极可使两侧电泳槽内缓冲溶液的正负离子相互交换，使缓冲液的pH值维持在一定程度每运用十次最好将缓冲液弃去•电泳槽两侧的缓冲液面应坚持同一程度面，否那么经过薄膜时有虹吸景象，将会影响蛋白质分子的电泳速度•电泳失败的缘由:• ①电泳图不完好;②蛋白组分分别不佳；③染色后蛋白质中间着色浅；④薄膜透明不完全；⑤透明膜上有气泡 临床意义•血清蛋白经过醋酸纤维素薄膜电泳，通常可以分别得到〔Alb〕、α 、β 、γ-球蛋白正常人血清中各种蛋白组分的浓度差别较大，所以在许多病理情况系会发生细微的变化，往往没有特意的临床诊断价值分析各种疾病的电泳分析结果，可看出显著变化 •血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分,含量为60～80g/L ,绝大部分由肝脏合成,仅γ球蛋白由浆细胞合成正常值: •白蛋白57%—72% •α1球蛋白2%—5% •α2球蛋白4%—9% •β球蛋白6.5%—12% •γ球蛋白12%—20% •血浆蛋白的主要功能: 维持血浆胶体浸透压 调理血浆pH值,维持酸碱平衡 运输营养物质,代谢物,激素,药物及金属离子等 免疫作用 血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾病参考。
肝炎:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白,β-球蛋白下降,γ-球蛋白升高 肝硬化:白蛋白,a1-球蛋白,a2-球蛋白下降明显, γ-球蛋白极度升高 肾病综合症:白蛋白降低,α2和β球蛋白升高 。