实验三、天然产物中多糖的分离、纯化与鉴定第一部分多糖的提取、纯化1、 目的要求了解多糖提取和纯化的一般方法2、 实验原理多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子早在60年代，人们就 发现多糖复杂的生物活性和功能它可以调节免疫功能，促进蛋白质和核酸的生物合成，调 节细胞的生长，提高生物体的免疫力，具有抗肿瘤、抗疡和抗爱滋病(AIDS)等功效由于高等真菌多糖主要是细胞壁多糖，多糖组分主要存在于其形成的小纤维网状结构交 织的基质中，利用多糖溶于水而不溶于醇等有机溶剂的特点，通常采用热水浸提后用酒精沉 淀的方法，对多糖进行提取影响多糖提取率的因素很多，如：浸提温度、时间、加水量以 及脱除杂质的方法等都会影响多糖的得率多糖的纯化，就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分一般是先脱除 非多糖组分，再对多糖组分进行分级常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟 三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag 方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4： 1比例混合，加到样品中振摇，使 样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。
本实验采用Sevag法(氯仿：正丁醇=4： 1混合摇匀)进行脱蛋白，用DEAE Sepharose 层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，得多糖级分3、 试剂和器材一、 试剂平衡缓冲溶液：0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2洗脱液：A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2氯仿、正丁醇、乙醇(95%)等，均为分析纯二、 材料灰树花子实体三、 器材DEAE Sepharose Fast Flow，旋转真空蒸发仪，摇床，离心机，层析柱：26x104、 操作方法一、 粗多糖的提取将多糖子实体切碎烘干后称量，采用热水浸提法，每次原料和水之比均为1： 5,浸提 温度为70°C —80°C，浸提时间3 —5h，共提取4次，合并4次浸提液真空旋转蒸发浓缩， 浓缩一倍体积对多糖提取液需进行脱色处理，即以1 %的比例加入活性炭，搅拌均匀15min 后过滤即可在浓缩液中加入3倍体积的乙醇搅拌，沉淀为多糖和蛋白质的混合物，此为粗 多糖它只是一种多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋 白质和无机盐，必须进一步分离纯化。
二、 粗多糖的纯化粗多糖溶液加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇=3： 1混合摇匀)后，置恒温振荡器中震荡过 夜，使蛋白质充分沉淀，离心(3000r /min)分离，去除蛋白质然后浓缩，透析，加入4倍 体积的乙醇沉淀多糖，将沉淀冻干取样品0.1g溶于10ml 0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2的平衡缓冲液中上样，用Buffer A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; Buffer B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2 进行线性洗脱，分部收集各管用硫酸苯酚法检测多糖合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻 干，即得多糖级分第二部分多糖的鉴定1、 目的要求(1) 了解薄层层析法分析单糖组分的原理和方法2) 了解红外光谱法鉴定多糖的原理和方法2、 实验原理采用薄层层析法分析单糖组分薄层层析显色后，比较多糖水解所得单糖斑点的颜色和 Rf值与不同单糖标样参考斑点的颜色和Rf值，确定样品多糖的单糖组分多糖的分析鉴定一般借助于气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(IR)和紫外 光谱(UV)等技术，气相(液相)色谱一质谱(GC / HPLC—MS)联用技术成为分析多糖更为有效 的手段。
本实验利用红外光谱对多糖进行鉴定多糖类物质的官能团在红外谱图上表现为相应的 特征吸收峰，我们可以根据其特征吸收来鉴定糖类物质0—H的吸收峰在3650—3590cm 一1，C—H的I申缩振动的吸收峰在2962—2853cm—1，C=O的振动峰为1510—1670—1 之间的吸收峰，C—H的弯曲振动吸收峰为1485—1445cm — 1，毗喃环结构的C—0的吸收 峰为 1090cm — 13、 试剂和器材一、 试剂浓硫酸，氢氧化钡展开剂:正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：醋酸：乙醇：水：毗啶=7： 20： 12： 7： 6： 6显色剂:1，3—二羟基萘硫酸溶液(0.2%1，3一二羟基萘乙醇溶液)：浓硫酸=1： 0.04 (V/V)单糖标准品二、 器材沸水浴，玻璃板，傅里叶变换红外光谱4、 操作方法一、单糖组分分析1 .薄层板制备：称取硅胶5g于50ml烧杯中，加入用12 mL 0.3mol/ L磷酸二氢钠水 溶，用玻璃棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀，铺在玻璃板上(7. 5cmx10cm)，110°C活化1h即 置有干燥剂的干燥箱中备用2. 点样：称取少许的多糖(0.1克)于2. 0mL离心管中，加入1M的硫酸1mL，沸水 浴水解2h，然后加氢氧化钡中和至中性，过滤除去硫酸钡沉淀，得多糖水解澄清液。
以此 水解液和单糖标准品进行点样进行薄层层析展开用点样器点样于薄层板上，一般为圆点， 点样基线距底边2.0cm，点样直径为2—4mm，点间距离约为1.5—2.0cm，点间距离可视斑 点扩散情况以不影响检出为宜点样时必须注意勿损伤薄层表面3. 展开：展开室如需预先用展开剂饱和，将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中， 浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5—1.0cm (切勿将样点浸入展开剂中)，密封室盖，等 展开至规定距离(一般为10—15cm)，取出薄层板，晾干4. 显色：将展开凉干后的薄板再在100C烘箱内烘烤30分钟，将显色剂均匀地喷洒在 薄板上，此板在110C下烘烤10分钟即可显色薄层显色后，将样品图谱与标准样图谱进行比较，参考斑点颜色、相对位置及Rf值， 确定样品中有哪几种糖二、红外光谱在多糖分析上的应用将冻干后的样品用KBr压片，在4000〜400cm-1区间内进行红外光谱扫描，有如下的 多糖特征吸收峰：3401 cm-1 (0-H)，2919 cm-l(C-H), 1381 cm-1 及 1076 cm-1 (C-0) 在900 cm-1处的吸收峰说明该多糖以8糖苷键连接在N-H变角振动区1650-1550cm-1 处有明显的蛋白质吸收峰，表明该样品是多糖蛋白质复合物。
° 皿 1 I 1 r- ——谕 拥瞄 m 审花 g胡g |网图5.2多糖样品的FT-IR图谱。