亲和纯化亲和纯化亲和纯化亲和纯化高等生物分离工程高等生物分离工程一、亲和层析一、亲和层析 (一一)亲和层析的原理亲和层析的原理 (二二)亲和层析的特点亲和层析的特点 (三三)亲和层析的基本概念亲和层析的基本概念 (四四)亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作 (五五)亲和层析的应用与实例亲和层析的应用与实例二、金属鳌合层析二、金属鳌合层析三、亲和膜三、亲和膜本章主要内容本章主要内容n酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等）酶与辅酶或酶与底物（产物或竞争性抑制剂等）n抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白，抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白，凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体）凝集素与多糖（或糖蛋白、细胞表面受体）n核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）核酸与互补链（或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白）n细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等细胞与细胞表面特异蛋白（或凝集素）等亲和层析亲和层析AffinityChromatography许多物质都具有和某化合物发生特异性许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性可逆结合的特性 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物亲和层析法就是利用化学方法将可与待分离物 质可逆性特异结合的化合物（称配体或配基）连接质可逆性特异结合的化合物（称配体或配基）连接质可逆性特异结合的化合物（称配体或配基）连接质可逆性特异结合的化合物（称配体或配基）连接 到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大当待提纯的生物大分子通过此层析柱时，此生物大 分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其 他物质则被冲洗出去。
然后再用适当方法使这种生他物质则被冲洗出去然后再用适当方法使这种生他物质则被冲洗出去然后再用适当方法使这种生他物质则被冲洗出去然后再用适当方法使这种生 物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离物大分子从配体上分离并洗脱下来，从而达到分离 提纯的目的提纯的目的提纯的目的提纯的目的一）亲和层析的原理（一）亲和层析的原理配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质游离配体游离配体杂质杂质n亲和的一对分子中的一方以共价亲和的一对分子中的一方以共价 键形式与不溶性载体相连，作为键形式与不溶性载体相连，作为固定相吸附剂固定相吸附剂n当含有混合组份的样品当含有混合组份的样品(流动相流动相)通过此固定相时，只有和固定相通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出和力的无关组份就随流动相流出 n然后改变流动组成份，将结合的然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来亲和物洗脱下来(一一)亲和层析的原理亲和层析的原理亲和结合包括以下几个方面的相互作用亲和结合包括以下几个方面的相互作用:n静静电电作作用用 亲亲和和作作用用分分子子对对的的结结合合部部位位上上带带有有相相反反电电荷荷时时,产产生生静静电电引力引力。
n氢氢键键 如如果果亲亲和和作作用用分分子子对对的的一一方方分分子子中中含含有有氧氧原原子子或或氮氮原原子子,结结合合部位之间可以产生氢键作用部位之间可以产生氢键作用n疏疏水水性性相相互互作作用用 如如果果亲亲和和作作用用分分子子对对的的一一方方分分子子上上含含有有芳芳香香环环或或烃烃基基链链等等疏疏水水基基,另另一一方方的的结结合合部部位位上上也也含含有有疏疏水水区区,则则两两者者之之间间可可发发生疏水性相互作用生疏水性相互作用n配配位位键键 如如果果亲亲和和作作用用分分子子对对均均与与同同一一金金属属原原子子配配位位,则则两两者者之之间间可可以通过金属配位键间接结合以通过金属配位键间接结合n弱共价键弱共价键 结合力较弱的可逆共价键结合力较弱的可逆共价键一一)亲和层析的原理亲和层析的原理(二二)亲和层析的特点亲和层析的特点纯化过程简单、迅速，且分离效率高纯化过程简单、迅速，且分离效率高3 1纯化倍数大，产物纯度高纯化倍数大，产物纯度高3 3必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件条件3 4特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子3 2亲和层析载体的选择亲和层析载体的选择n具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过n具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速n具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有惰性，尽量减少非专一性吸附n具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价和具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价和偶联偶联n在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性(三三)亲和层析的基本概念亲和层析的基本概念亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择常用的亲和层析载体常用的亲和层析载体纤维素纤维素纤维素葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶多孔玻璃珠多孔玻璃珠多孔玻璃珠1 1）纤维素：）纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料，取材自然界中数量最大的大分子生物材料，取材十分方便。
但由于其结构紧密、均一性差，不利于大分子十分方便但由于其结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加上空的渗入活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛目前主要用于间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛目前主要用于分离与核酸有关的物质分离与核酸有关的物质2 2）琼脂糖凝胶：）琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快功能基团，结构疏松孔径大，流速快常用的亲和层析载体常用的亲和层析载体亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择3 3）葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶：与与琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶相相比比孔孔径径太太小小，特特别别是是经经配配基基偶偶联联后后，凝凝胶胶膨膨胀胀度度会会进进一一步步变变小小，所所以以应应用用受受到到限限制4 4）聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶：碳碳碳碳骨骨架架，由由丙丙烯烯酰酰胺胺和和甲甲叉叉双双丙丙烯烯酰酰胺胺聚聚合合而而成成，具具有有网网状状三三维维空空间间结结构构。
注注意意避避免免接接触触强强氧氧化化剂剂，配配基基偶偶联联后后会会使使它它的的网网格格缩缩小小，在在一一定定程程度度上限制了它的应用上限制了它的应用常用的亲和层析载体常用的亲和层析载体亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择 5 5）多孔玻璃珠：）多孔玻璃珠：化学和物理稳定性好，机械强度高，不但化学和物理稳定性好，机械强度高，不但能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的能抵御酶及微生物的作用，还能耐受高温灭菌和较剧烈的反应条件缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白反应条件缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少质有非特异性吸附，而且可供连接的化学活性基团也少改良方法：用葡聚糖包被玻璃珠，则可改善其亲水性并增加化改良方法：用葡聚糖包被玻璃珠，则可改善其亲水性并增加化学活性基团用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细学活性基团用抗原涂布的玻璃珠已成功地分离了免疫淋巴细胞，在胞，在DNADNA连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的连接的玻璃珠上纯化了大肠杆菌的DNADNA和和RNARNA聚合酶常用的亲和层析载体常用的亲和层析载体亲和层析载体的性质与选择亲和层析载体的性质与选择n纯化对象和配体之间必须有较强的亲和力纯化对象和配体之间必须有较强的亲和力n但亲和力太高也是有害的，因为在解离配体复合物时所需但亲和力太高也是有害的，因为在解离配体复合物时所需的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性的条件就要强烈，这样可能使生物分子变性n配体必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配体与生配体必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配体与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配体与生物分子之间的亲和力响配体与生物分子之间的亲和力亲和层析配体的性质与选择亲和层析配体的性质与选择亲和层析配体的选择亲和层析配体的选择亲和层析配体的选择亲和层析配体的选择亲和层析配体的性质与选择亲和层析配体的性质与选择配体的偶连配体的偶连配体的偶连配体的偶连酸酐法酸酐法酸酐法酸酐法酸酐法酸酐法N-N-N-取代羟基琥珀酰亚胺法取代羟基琥珀酰亚胺法取代羟基琥珀酰亚胺法叠氮化作用叠氮化作用叠氮化作用还原性烷基化合物（西夫碱）的形成还原性烷基化合物（西夫碱）的形成还原性烷基化合物（西夫碱）的形成1,非特异性洗脱非特异性洗脱n通常采用改变通常采用改变pHpH、离子强度、离子种类或者温度等使与固离子强度、离子种类或者温度等使与固定配体结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，定配体结合的生物大分子的构象发生变化，降低其亲和力，但使用较广泛的是改变溶液的离子强度。
但使用较广泛的是改变溶液的离子强度n非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配体形成复象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配体形成复合物，使固定化的配体对相应的生物大分子的亲和力降低合物，使固定化的配体对相应的生物大分子的亲和力降低四四)亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作 洗脱类型洗脱类型(一一)2,特异性洗脱特异性洗脱n使用特异的配体作为洗脱剂使用特异的配体作为洗脱剂n使用含有与亲和配体或目标产物具有亲和作用的小分子化使用含有与亲和配体或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配体或目标产物的竞争性合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配体或目标产物的竞争性结合来洗脱目标产物结合来洗脱目标产物(四四)亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作3,特殊性洗脱特殊性洗脱n亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配体亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配体与载体的连接键，获得的配体与载体的连接键，获得的配体-蛋白络合物后，再除去配体蛋白络合物后，再除去配体实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法。
实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法四四)亲和层析的基本操作亲和层析的基本操作 洗脱方式洗脱方式(二)1,一步洗脱一步洗脱u 属于非选择性洗脱方法，应用于高度特异性吸附剂属于非选择性洗脱方法，应用于高度特异性吸附剂 的结合，经过一次洗脱将被吸附物质全部洗脱下的结合，经过一次洗脱将被吸附物质全部洗脱下 来，就可得到较纯的分离物来，就可得到较纯的分离物u 非选择性洗脱主要受洗脱液的非选择性洗脱主要受洗脱液的pHpH、离子。