肉牛冲胚方案1供体选择和超数排卵1.1供体牛的选择1.1.1供体牛要求健康状况良好，体况中等以上，生殖系统和繁殖功能正常， 无遗传和传染性疾病1.1.2青年母牛应在14个月龄以上或达到成年牛体重70%以上（300〜350kg）1.1.3超排处理时，供体牛应具有两个正常发情周期，卵巢发育正常、丰满 有弹性，并有发育良好的黄体1.1.4筛选出的供体牛应在牛体上作好标记，仔细观察发情，并记录耳号和 发情时间1.2供体牛的饲养管理应提供较高能量日粮标准，并适量补充青绿饲料、维生素A、D、E和微量 元素硒2超数排卵处理方法诱导卵泡波同步发生方法进行超数排卵处理，即在发情周期的任意一天放 入含孕激素的阴道栓，放置阴道栓4 d后（放阴道栓当天为0 d），开始连续4 d 肌肉注射FSH（8~10mg），每天2次，间隔12 h在首次注射FSH后48 h肌 肉注射PG 0.4 mg /头.次，再间隔12 h撤栓注射PG后48 h观察发情和人工 授精不同FSH制剂应根据使用说明来确定用法和用量，使用新厂家或新批 号的FSH时，应作超排效果预试验3供体牛的人工授精发情后12 h进行第一次输精,每间隔12 h再输精一次,每次一支细管精液， 共输精2〜3次。
4胚胎采集（采卵）及处理4.1胚胎采集时间供体发情后第7 d （发情当天为0 d）采集胚胎4.2胚胎采集4.2.1麻醉将供体牛前高后低站立保定后，掏净直肠内的宿粪，可采用2%普鲁卡因在 荐椎和第一尾椎间隙注射4 ml~5 ml，实施硬膜外腔麻醉，其它麻醉剂按说明书 使用4.2.2外阴清洗、消毒麻醉后将牛尾栓系在牛体一侧，用清水冲洗会阴部和外阴周围，再用0.1 % 新洁尔灭或0.1 %高锰酸钾冲洗消毒，用灭菌纸巾擦干，最后用酒精棉球擦拭消 毒外阴部4.2.3吸除子宫颈粘液用粘液吸除器吸除子宫颈粘液对青年母牛或子宫颈通过困难的供体牛，可 先用子宫颈扩张棒扩张子宫颈，再吸除子宫颈粘液4.2.4米胚通过直肠把握，将带有钢芯的冲胚管经过子宫颈轻轻地插入一侧子宫角大弯 处，抽出少许钢芯，再将冲胚管送到子宫角大弯前至小弯基部给气囊充气，根 据母牛年龄及子宫大小和采胚管的深度确定充气量（一般充气8 ml〜10 ml）固 定冲胚管，抽出钢芯，开始灌注采胚液，用前加温至37 °C采胚时，将采胚液吊瓶挂在距外阴部1.0 m高处，接通三通管（Y型）及采 胚管与集卵杯根据子宫角的膨胀程度确定采胚液注入量的多少，一般每次注入 30 ml〜50 ml采胚液，视液体回流情况，然后反复多次冲灌，每侧子宫角用液量 300 ml〜500 ml。
冲完一侧子宫角后将钢芯再插入采胚管并放气，小心固定钢芯， 把采胚管退到子宫体，转向插入另一侧子宫角，重复上述操作4.2.5米胚后处理两侧子宫角采胚完毕，向子宫体灌注抗生素（青霉素80万IU和链霉素100 万IU）或0.1 %~0.2 %碘甘油溶液30 ml〜40 ml同时，肌肉注射PG 0.4 mg，在 采胚2 d后，再注射0.4 mg PG4.3检胚4.3.1回收液处理4.3.1.1集卵杯法：用20 G针头的注射器吸20 ml冲胚液从上向下冲洗集卵 杯内侧的尼龙网4次〜5次，清除杯中的泡沫后镜检4.3.1.2过滤杯法：采胚时滤去回收液，最后将杯中留下的20 ml~30 ml回 收液倒入平皿，再用少量冲卵液冲洗过滤杯2次〜3次，一并倒入平皿镜检4.3.2镜检将回收冲胚液的平皿在10倍〜20倍体视显微镜下，从上到下、从左到右或 从外到内Z字形移动，用吸胚管（直径200 ”m~300 将找到的胚胎移入培养皿中的保存液小滴中，然后将同一供体母牛的胚胎从液滴中全部吸出移到新液 滴，并反复洗涤胚胎3次〜5次然后将体视镜放大至50倍以上，进行胚胎质量 鉴定和分级4.3.3胚胎发育阶段分类胚胎发育阶段分类应符合表1要求。
表1胚胎发育阶段和形态特征胚胎发育阶段形态特征早期桑椹胚(Early Morula，EM)含有16个细胞以上，卵裂球紧界限清晰，没有形 成致密细胞团致密桑椹胚(Compacted morula， CM)卵裂球进 步分裂变小，紧缩为团块状，看不清卵 裂球界限，细胞团占据透明带内的60%〜70%空间早期囊胚(Early blastocyst，EB)细胞团中出现散在的囊腔，细胞团占据透明带内的 70%〜80%空间囊胚(Blastocyst， BL)已经分化的滋养层和内部致密的、颜色发暗的内细 胞团和囊胚腔明显是主要特征滋养层与内细胞团 的形态比较容易区别此时的胚胎细胞充满整个透 明带内扩张囊胚(Expanded blastocyst， EXB)整个胚胎直径增大，囊胚腔充分扩张，与透明带之 间无间隙，透明带变薄，大约是原来厚度的1 /3孵化囊胚 (Hatching blastocyst， HB)正处于孵化阶段的胚胎透明带破裂或胚胎细胞团 正在脱出或者已脱离透明带4.3.4胚胎发育日龄标准胚胎发育日龄标准应符合表2要求表2胚胎发育日龄标准胚胎发育阶段胚胎日龄胚胎发育阶段胚胎日龄单细胞1d致密桑椹胚6d2-细胞2d早期囊胚7d4-细胞3d囊胚7d~8d8-细胞4d扩张囊胚8d~9d16-细胞5d孵化囊胚9d早期桑椹胚5d~6d4.3.5胚胎质量形态学鉴定及分级胚胎质量形态学鉴定及分级应符合表3的要求。
表3胚胎形态学鉴定及分级等级特 征A级胚胎发育阶段与胚龄 致，透明带光滑无缺陷，胚胎细胞团形态完整，轮 廓清晰，卵裂球大小均匀，结构紧凑、色泽和透明度适中，无游离细胞或 很少，变性细胞比例少于10%B级胚胎发育阶段与胚龄基本一致，轮廓清晰，胚胎细胞团形态较完整，卵裂 球大小基本一致，色泽和细胞透明度良好，变性及游离细胞约占 10%〜30%C级胚胎发育阶段与胚龄不太一致，且胚胎细胞团轮廓不清，色泽和透明度变暗，卵裂球较松散游离，变性及游离细胞约占30%〜50%可用作鲜胚移 植D级未受精卵，或发育停滞变性、卵裂球不规则、少而散D级不可用4.4胚胎洗涤4.4.1胚胎应用无菌的保存液洗涤5次，每次洗涤不少于200仏14.4. 2每组清洗胚胎数不能超过10枚4.4. 3每次清洗应更换无菌吸管4.4. 4每次清洗胚胎带入平皿中的液体量不能超过1%4.5胚胎冷冻保存与解冻4.5.1乙二醇冷冻胚胎直接移植法程序4.5.1.1将胚胎放入1.5 mol/L或1.8 mol/L乙二醇冷冻保护液中，平衡10 min,迅速装入0.25 ml细管装管顺序：乙二醇液，气泡，含有胚胎的乙二醇 液，气泡，乙二醇液，封口。
每支细管可装1枚或1枚以上胚胎见下图： 棉塞 乙二醇液 乙二醇液+胚胎 乙二醇液封口处标签管I O O ■ —气泡 气泡4.5.1.2 标记装管后，采用聚乙烯醇粉或封口机封口，或用标签塞插入封口端，标记内 容：生产单位（代号）标记品种和供体牛号及种公牛号，胚胎发育阶段、等级 及数量、胚胎生产时间等，乙二醇冷冻的胚胎应标记直接移植DT符号4.5.1.3植冰：胚胎放入-6 °C或-7 °C冷冻仪平衡5 min后，用经过液氮冷却 后的镊子夹住塑料细管封口端（远离胚胎端）植冰4.5.1.4冷冻：植冰后，平衡10 min，以0.3 C/min ~0.5 C/min速率进行降 温，达到-32 C~ -35 C时，平衡10 min,把细管投入液氮中4.5.2解冻：从液氮罐中取出细管，空气中停留5 s,投入32 C水浴中，待 冰晶消失后取出细管，用酒精棉球擦干、消毒后，剪开封口，直接装入移植器, 进行移植附录A试剂与药品同期发情、超数排卵和胚胎采集所需药品和溶液A. 1同期发情和超排所需要的药品和激素A.1.15%〜10% 碘酊A.1. 2 0.1% 新洁尔灭A.1. 3生理盐水溶液A.1..4促卵泡素（FSH）。
A. 1.5前列腺素（PG）或其类似物A. 2胚胎采集所需药品和溶液A. 2.1 5%~10% 碘酊A.2.2 0.1% 新洁尔灭A. 2.3生理盐水溶液A. 2.4 2% 普鲁卡因A. 2.5青霉素和链霉素A. 2.6采胚液、保存液、冷冻液附录B设备与耗材B. 1超数排卵、人工授精和胚胎移植所需器材B.1.1 5ml、10ml、20ml、50m 1 一次性注射器及针头B.1.2牛用开膣器B.1.3 CIDR 放置器B. 1.4牛用输精枪；输精枪塑料硬外套；输精枪塑料软外套膜B. 2胚胎采集所需器材B.2.1母牛用3路胚胎采集器B.2.2可延伸采胚管B. 2.3青年母牛用2路胚胎采集器B.2.4青年母牛用2路采胚管B.2.5 24”采胚管钢芯B.2.6采胚器软管B.2.7宫颈扩张器B.2.8 20ml 注射器B.2.9 10ml 注射器B.2.10 5ml 注射器B.2.11杯形过滤器B.2.12直径100mm的培养皿B.2.13剪毛剪B.2.14 1000ml 容量瓶B.2.15封口膜，70%酒精棉球B. 3胚胎处理、鉴定和冷冻保存所需设备和器材B.3.1体视显微镜10X〜100XB.3.2电热恒温盘或恒温板。
B.3.3直径100mm的培养皿B.3.4胚胎吸管、微量移液器B.3.5胚胎程控冷冻仪B.3.6 0.25ml塑料细管B.3.7 0.22卩m针头式过滤器B.3.8细管塞B.3.9塑料薄膜封口机B.3.10标签记号笔附录C器具的洗涤与消毒C.1器具洗涤C.1.1玻璃器皿的洗涤C. 1.1.1浸泡：新购置的玻璃器皿使用前应先用自来水简单刷洗，然后用5%稀盐酸溶液浸 泡12h以上；培养后的玻璃器皿用后要立即浸入清水中，不应留有气泡C. 1.1.2刷洗：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂洗涤（宜选用软毛刷和优质的洗涤剂，如 高级洗衣粉或洗洁精）洗刷，洗刷时用力要轻，防刮底，防死角或用超声波洗涤器洗涤（20~30）min,水中加入洗涤剂C. 1.1.3浸酸：对于含有污垢难以洗刷的器皿要先在清洗液中（勿留气泡）浸酸浸酸时间 不应少于6hC. 1.1.4冲洗：刷洗和浸酸后都必须用水充分冲洗，使之不留任何残迹冲洗宜用洗涤装置， 以保证冲洗效果，如用手工操作，每瓶都得用水灌满，倒空，重复十次以上，最后再用蒸 馏水漂洗（2〜3）次，晾干备用C.1.2胶塞的清洗C. 1.2.1新购置的胶塞先用自来水冲洗干净后，再做常规处理。
C.1.2.2常规处理方法：浸泡、2%NaOH煮沸10min〜20min、自来水冲洗烘干后、1%稀盐 酸浸泡30min、自来水冲洗和蒸馏水各清洗（2〜3）次、晾干备用C.1.3塑料器皿的清洗培养使用的塑料器皿是一种无毒并已经消毒过灭菌密封包装的一次使用性物品用时， 只要打开包装即可集卵杯、冲卵管等可重复使用物品用后应立即浸入水中，并用流水冲 洗干净，晾干C.2器具消毒C.2.1紫外线消毒C.2.1.1对空气、操作台表面和一些不能使用其它方法进行消毒的培养器皿（如塑料培养皿、 培养板等）采用紫外线消毒C.2.1.2培养室的紫外线灯应距地面2.5米，塑料制品可放在无菌间距紫外灯50cm〜80cm处， 使每平。