真菌毒素检测技术交流农业部食品质量监督检验测试中心（ 上海）黄菲菲1n常见的真菌毒素的种类n毒素的分布n毒素的检测方法n毒素的检测标准2真菌毒素34黄曲霉毒素ü4种主要的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 ，加上代谢物M1可以直接地污染食品和饲 料ü在所有真菌毒素中，黄曲霉毒素B1的毒性 、致癌性、污染频率均居首位ü黄曲霉毒素B1是已知各种真菌毒素中最稳 定的一种5Ø 在紫外线下，黄曲霉毒素B1 、 B2发兰色荧光，黄曲霉毒 素G1、G2发绿色荧光 Ø 黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素 B1在体内经过羟化而衍生成 的代谢产物 Ø 黄曲霉毒素的分子量为312- 346难溶于水，易溶于油、 甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂 ，但不溶于石油醚、己烷和乙 醚中 6黄曲霉毒素n黄曲霉毒素常常存在于土壤、动植物 、各种坚果特别是花生和核桃中在 大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品 、牛奶、奶制品、食用油等制品中也 经常发现黄曲霉毒素一般在热带和 亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检 出率比较高 7赭曲霉毒素A（Ochratoxin A） n赭曲霉毒素是赭色曲霉属（ Ochraceors）和几种青霉属真菌产生 的一种毒素，包括A、B、C等7种结 构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素 A毒性最大。
赭曲霉毒素A是稳定的无 色结晶化合物，溶于极性溶剂和稀碳 酸氢钠溶液，微溶于水 8赭曲霉毒素An赭曲霉毒素A会对多种食用了受其污 染饲料的家畜和野生动物的肾脏造成 损害n一般容易感染赭曲霉毒素A的商品包 括：大豆、绿豆、绿咖啡豆、酒、啤 酒、葡萄汁、调味品、草本植物、猪 肾 9伏马毒素（Fumonisins） Ø伏马菌素是1989年发现的一种新型毒素 Ø白色粉末，易溶于水、甲醇及乙腈-水中 伏马菌素在乙腈-水(1+1)中稳定，在 25C下可保存6个月Ø目前至少已鉴定出15种不同的伏马菌素 的类似物，但大部分在自然界未被分离到 伏马菌素B1和B2是自然界存在最普遍 ，且毒性最强10伏马毒素n伏马菌素大多存在于玉米及玉米制品 中，其含量一般超过1mg/kg，研究证 实，在大米、面条、调味品、高粱、 啤酒中也有较低浓度的伏马菌素存在 11呕吐毒素 （deoxynivalenol，DON ） n呕吐毒素(Vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (Deoxynivalenol，DON)，主要产生菌是禾谷镰 刀菌它可导致动物肠功能紊乱(腹泻，呕吐)，口 腔黏膜和真皮损伤，免疫力下降当呕吐毒素含量 超过1 mg／kg时，就会引起猪采食量减少，体增 重减慢。
当饲料中呕吐毒素的浓度达4 mg／kg以 上时，会导致采食量严重下降、拒食、生产性能降 低n呕吐毒素一般在大麦、小麦、玉米、燕麦中含有较 高的浓度，在黑麦、高粱、大米中的浓度较低 12T-2毒素 n是单端孢霉烯族化合物之一 n它广泛分布于自然界，是常见的污染田间作 物和库存谷物的主要毒素，对人、畜危害较 大n1973年联合国粮农组织（FAQ）和世界卫生 组织（WHO）在日内瓦召开的联席会议上 ，把这类毒素同黄曲霉素一样作为自然存在 的最危险的食品污染源，尤其是美国指责前 苏联、越南在东南亚使用“黄雨（yellow rain）”毒素（其中含有T-2毒素）以后，有 关T-2毒素对人类健康的危害引起了各国科 学家的较大关注 13展青霉素n展青霉素还具有致畸性、致突变性和 致癌性 n主要存在于霉烂的苹果和山楂中14玉米赤霉烯酮(zearalenone， ZON) n玉米赤霉烯酮主要存在于玉米、玉米制品、干草和 青贮饲料中，小麦、大麦、高粱、大米、小米、芝 麻中也有一定程度的分布玉米赤霉烯酮主要污染 玉米、麦类、谷物等n玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒性和致畸作用，可 引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产 ，对家禽特别是猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业 带来经济损失。
饲料中1mg/kg的玉米赤霉烯酮就 会使动物产生雌性化，更高的浓度（50- 100mg/kg）将会对怀孕、排卵、移植、胎儿的 发育、新生动物儿的生存力产生不利的影响 15展青霉素 ü 无色结晶，分子式C7H6O4，相对分子质量 154，熔点为110℃，溶于水、乙醇、丙酮、 乙酸乙酯和三氯甲烷，微溶于乙醚和苯，不 溶于石油醚在酸性环境中展青霉素非常稳 定，加工过程中不被破坏但在碱性溶液中 不稳定，其生物活性被破坏展青霉素也称 为棒曲霉素 16限量要求17181920212223真菌毒素的检 测步骤24取样2526提取n提取剂：乙腈-水 或甲醇-水n提取方式：振荡 或均质27净化n液液萃取n固相萃取净化n多功能柱净化n免疫亲和净化28液液萃取液液萃取是利用相似相溶的原则,选择适 当的溶剂和萃取条件, 从混合物中萃 取黄曲霉毒素,从而达到分离的目的 液液萃取法设备简单,操作快速,特别 是分离效果好,故应用广泛.缺点是费 时,工作量较大;萃取溶剂常是易挥发 、易燃和有毒的物质，所以在应用上 受到限制29固相萃取净化优点： 1)不需要使用大量有机溶剂,减少对环境的污染 2)有效地将分析物与干扰组分分离，减少测定时的杂质干扰。
3）能处理小体积试样 4）回收率高，重现性好 4）固相萃取柱有较长的保质期 缺点： 1)非特异性 2)耗时30多功能柱净化优点： 使用方便、快捷 多功能柱有较长的保质期 可用于多种毒素的分析缺点： 非特异性31免疫亲和净化免疫亲和净化法结合了 单克隆抗体技术和亲和 柱技术，利用抗原-抗体 免疫反应的原理，选择 性吸附提取液中的毒素 ，以达到分离净化的目 的优点： Ø 特异性强、净化效果好 缺点： Ø 耗时 Ø 用于单一毒素的测定 Ø 价格比较贵、保存需冷藏32分析n定量：高效液相色谱法LC-MS/GC-MSn半定量薄层色谱酶联免疫法333435黄曲霉毒素的分析方法 n分析方法 薄层色谱法酶联免疫法ELISA免疫亲和－分光光度法免疫亲和-高效液相色谱法36薄层色谱法nTLC法能够容易地决定毒素是否存在, 而对 于毒素的定量分析只有在结合密度扫描的情 况下，才能完成薄层色谱法是黄曲霉毒素 检测中的经典方法，传统的TLC法样品前处 理繁琐且净化效果欠佳，使用双向展开进一 步增加了操作步骤和时间采用新型的净化 方式如固相萃取或免疫亲和柱净化结合TLC ，实现了单向展开，能缩短部分检测时间。
近年来，随着HPLC法的迅猛发展，TLC法已 逐渐被HPLC法替代37免疫亲和层析净化高效液相色谱 法 nGB/T18979-2003食品中黄曲霉毒素的 测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱 法和荧光光度法 38黄曲霉毒素M1的分析方法n黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在动物体内 的代谢产物，并能够进入乳汁，因此对黄曲 霉毒素M1的检测对象一般都是及动物的组 织、乳及其制品目前，黄曲霉毒素M1的 检测方法有薄层色谱法（TLC）、酶联免疫 吸附法（ELISA）、免疫亲和柱层析净化荧 光光度法（IA-Fluorometer）和免疫亲和柱 层析净化高效液相色谱法（IA-HPLC）和液 相色谱法（HPLC）等39n薄层色谱法（TLC）（GB/T 5009.24-2003 ） n酶联免疫吸附法（ELISA）n免疫亲和柱层析净化荧光光度法（IA- FLUOROMETER）和免疫亲和柱层析净化 高效液相色谱法（IA-HPLC）（GB/T 18980-2003） 40nGB/T 8381-2008饲料中黄曲霉毒素B1的测定 半定量薄 层色谱法nGB/T 17480-2008饲料中黄曲霉毒素B1的测定 酶联免疫 吸附法 LOD 0.1 ug/kgnNY/T1664-2008 牛乳中黄曲霉M1的快速检测 双流向酶 联免疫法 LOD 0.5 ug/kgnSN/T1664-2005牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1、B1、B2 、G1、G2含量的测定HPLC 法 免疫亲和柱净化，经三氟乙酸衍生后，HPLC 测定 LOD奶粉0.08 ug/kg 牛奶0.008 ug/L41nGB/T18979-2003食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光 度法nGB/T 18980-2003 乳和乳粉中黄曲霉毒素 M,的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱 法和荧光光度法nGB/T5009.23-2003食品中黄曲霉毒素B1、 B2、G1、G2的测定ü薄层色谱法ü微柱法ü液相色谱法-多功能柱净化-三氟乙酸衍生4243T-2毒素nGB/T 5009.118-2008 谷物中T-2毒素的测定HPLC 法 免疫亲和柱净化，衍生后，HPLC 测定 LOD 10ug/kgELISA LOD 1 ug/kgELISA LOD 1 ug/kgnSN/T1771-2006 进口粮谷中T-2毒素的测定 HPLC 法 免疫亲和柱净化，衍生后，HPLC 测定 LOD 10ug/kg44赭曲霉毒素A的测定方法nGB/T5009.96-2003 谷物和大豆中赭曲 霉毒素A的测定方法 TLC 法 LOD 10 ug/kgnGB/T19539-2004 饲料中赭曲霉毒素A 的测定 TLC 法 LOD 2ngELISA LOD 0.05ng45玉米赤霉烯酮nGB/T19540-2004 饲料中玉米赤霉烯 酮的测定 TLC 法 LOD 20 ngELISA LOD 0.25ng46呕吐毒素nGB/T5009.111-2003 谷物及其制品中 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定（呕吐毒 素）TLC 法 LOD 0.1mg/kgELISA LOD 0.1ng/kg47展青霉素nNY/T1650-2008苹果及山楂制品中展青霉素的测定 高效液相色谱法 乙腈提取，Mycosep228多功能柱净化LOD 液体样品 8 ug/L 固体样品 10 ug/ kgnSN/T1859-2007 饮料中棒曲霉素和5-羟甲基糠醛的 测定方法 液相色谱-质普法和气相色谱-质谱法LC-MS 乙酸乙酯提取，碳酸钠净化，LOD 10 ug/LGC-MS 乙酸乙酯提取，碳酸钠净化,经BSTFA衍 生 LOD 10 ug/LnGB/T5009.185-2003苹果及山楂制品中展青霉素的 测定 薄层色谱法4849我国目前国家标准存在的问题50能力验证nFAPAS®食品分析能力评价体系由英 国农业渔业和食品部创办于1990年， 由英国政府通过位于约克的中心科学 实验室CSL（Central Science Laboratory）负责管理，属于非赢利 性的官方组织。
51n英国FAPAS®分析实验室能力验证是专门 从事食品、水质、化工等检测方面的能力验 证机构，通过实验室间测试结果的比对来判 定实验室能力的合格评定活动通过开展能 力验证，可发现实验室存在的问题和监控实 验室的运行状态，提高实验室检测能力和检 测水平，确保检测出证的质量该体系在全 世界各国的食品分析实验室迅速普及，目前 它已是食品分析领域全球第一的国际评价体 系同时FAPAS®所提供目前世界上最广 泛的测试材料52本中心参加的毒素方面的能力验 证---结果均为满意n奶粉中黄曲霉M1的测定--2006.09n牛奶中黄曲霉M1的测定--2007.01n谷物中赭曲霉毒素A的测定--2007.09n早餐谷物中玉米赤霉烯酮的测定-- 2008.01n花生中黄曲霉B1、B2、G1、G2及黄曲霉 总量的测定--2008.07n燕麦片中T-2毒素的测定--2009.0153花生中黄曲霉总量的测定 n称样n提取。