《近代生物学研究技术》实验操作实验一、用三亲本杂交进行细菌质粒的接合转移实验一、用三亲本杂交进行细菌质粒的接合转移第一天内容： 受体、供体、辅助菌混合培养1、供体菌：E.coli DH5α(pTR102-luxAB) (Tc R、luxAB + ） 2、受体菌: Sinorhizobium fredii ( Tc S, luxAB - )3、辅助菌: E. coli MM294 (pPK2073)（Spe R）教师准备：将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期：pTR102-luxAB：LB +Tc 20μg /ml，37OC震荡1夜；S. fredii ：TY, 28OC震荡培养2天 ；pPK2073： LB + Spe 50 μg/ml 37OC震荡1夜学生操作（第一天） ： (1)吸取供体菌、辅助菌各 0.4ml，吸受体菌0.6ml，都加 入同一个1.5ml离心管内（1管 / 人），8000转/min 离 心1分钟2) 倒上清，向沉淀加 1ml TY液体，tip上下抽吸，洗菌 体，8000转/min离心1分钟，倒上清，留沉淀3) 用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好的TY平板上， 1片 / 人 ，3片 / 平板，平皿背面标记姓名。
4）用200μl的 tip 抽吸离心管内沉淀的菌体，打散成浓 菌液，将之加到滤纸片中央（切勿倾斜平板，以免菌液 流出滤纸片以外）(5)平板静置5～10分钟，待滤纸上的培养基液体被平板吸 收后，倒置放培养箱，28OC 培养 1~2天第二天内容：洗含菌滤纸，涂选择平板 （1）灭菌小PA瓶中加5ml无菌水 (1瓶 /人), 镊子揭下TY 平板上的滤纸片，放瓶中，在震荡混匀器上充分打散菌 体2）向1.5ml管加0.9ml无菌水,加0.1ml已打散的菌液,稀 释10倍，混匀3）吸已稀释的菌液分别涂布于 SM+Tc 平板（每人1板 ）和不加 Tc的纯SM（每组1板）上（200μl / 板）（4）放 28OC 培养6-7天，下周看结果：在暗室内向培养皿中加10μL癸醛，3－5分钟后即可 看到转移接合子发出的微弱荧光SM+Tc平板的单菌落数质粒转移频率＝纯SM平板的单菌落数 。