中药材掺假染色检测方法的研究中国药品生物制品检定所 中药室 鲁 静 2009-05色彩与人类 生活息息相关“红心鸭蛋”事件 中药材掺假染色 中药材掺假染色检测方法研究的必要和 紧迫性 n着色物：色素、染料、颜料等的滥用，严重危 害人民身体健康和生命安全；n掺伪、造假等现象屡禁不止 ，严重影响中药 的声誉和健康发展中药材掺假染色检测方法研究的必要 和紧迫性n药品检验机构对假、劣中药材、中药饮片，研 究建立针对性的检测方法，申报补充检验方法 ，获得法定检验标准依据，对于有效打击制假 、售假的不法行为，净化中药材市场，保证人 民群众用药安全，具有很重要的意义中药材掺假染色的主要方式和品种n增重掺假染色 红花 冬虫夏草、青黛等n劣质药材染色 五味子 蒲黄 延胡索 等n造假染色 西红花 血竭 朱砂 等 着色物的种类n食用色素（水溶性色素） 食品添加剂n合成染料 可溶于使用介质 纺织品着色 被纤维吸附、固着n有机颜料 不溶于使用介质 非纺织品着色 靠树脂、胶黏剂等于着色物结合 n无机或矿物颜料着色物（合成）的基本化学结构n偶氮类n蒽醌类 n三芳基甲烷类 苋菜红赤藓红亮蓝禁用染料含有偶氮结构的染料在经过裂解后有可能产生以下24种致癌芳香 胺的染料是被欧盟和许多国家禁止使用的。
24种致癌芳香胺是： （1）4-氨基联苯 （2） 联苯胺 （3）4-氯-2-甲基苯胺 （4）2-萘胺 （5）4-氨基-3,2’-二甲基偶氮苯 （6）2-氨基-4-硝基甲苯 （7）2,4-二氢基苯甲醚 （8）4-氯苯胺 （9）4,4’-二氨基二苯甲烷 （10）3,3’-二氯联苯氨 （11）3,3’-二甲氧基联苯胺 （12）3,3’-二甲基联苯胺 （13）3,3’-二甲基-4,4’-二氨基二苯甲烷 （14）2-甲氧基-5-甲基苯胺 （15）4,4’-亚甲基-二（2-氯苯胺） （16）4,4’-二氨基二苯醚 （17）4,4’-二氨基二苯硫醚 （18）2-甲基苯胺 （19）2,4-二氢基甲苯 （20）2,4,5-三甲基苯胺 （21）2-甲氧基苯胺 （22）4-氨基偶氮苯 （23）2,4-二甲基苯胺 （24）2,6’-二甲基苯胺 食用色素n天然食用色素：焦糖色素、红曲红、高梁红、 栀子黄、萝卜红、叶绿素铜钠盐、胡萝卜素、 可可壳色、姜黄等n我国食品添加剂使用卫生标准（GB2760－1996 ）列入的合成色素有胭脂红、苋菜红、日落黄 、赤藓红、柠檬黄、新红、靛蓝、亮蓝、二氧 化钛（白色素）等等 合成食用色素n合成色素具毒性(包括毒性、致泻性和致癌性)。
这些毒性 源于合成色素中的砷、铅、铜、苯酚、苯胺、乙醚、氯化 物和硫酸盐，它们对人体均可造成不同程度的危害n我国《食品添加剂使用卫生标准》，其中规定使用合成色素的种类，并定出了最大使用量n合成色素的纯色素含量不得低于85～99％；砷<1ppm; 铅<10ppm; 铜<20ppm; 苯酚<5ppm，苯胺<4ppm; 各种氯化物 不应超过0.5％等，这些规定是为了限制色素中的杂质， 以减少对人体的毒害合成染料n偶氮染料苏丹红IV酸性橙II n三芳基甲烷类金胺O孔雀石绿颜料n普通有机颜料 偶氮类颜料 酞箐颜料n无机颜料 二氧化钛 铅铬绿 等等着色物的危害n偶氮染料 致癌性过敏性 n蒽醌类染料 癌诱变性皮肤过敏性 n三芳基甲烷类染料致癌对眼睛的刺激对水生生物的毒性中药材掺假染色检测方法研究的内容（1）关注药材质量，及时发现问题； （2）确定掺伪物、染色物的种类；明确化学组 成； （3）建立检测用对照物质； （4）建立检测方法，进行必要的方法验证； （5）按规定程序申报补充检验方法，作为法定 检验的依据中药材掺假染色检测的技术方法n经验鉴别、理化鉴别——快速筛查n薄层色谱法——定性鉴别、常规检测n高效液相色谱法——定性鉴别、常规检测n液-质联用法——结构鉴定、方法验证中药材掺假染色检测方法研究实例 n单一色素或染料染色7 34 39 40 42 A B C D E F G H I J K L 对照红花染色物 金橙II的检测 硅胶G薄层板 展开剂：氯仿-甲醇-冰乙酸(7：1：2)金橙II的HPLC检测 色谱柱：Diamonsil C18 流动相：乙腈－0.025mol/L磷酸二氢钾溶液（含 0.2%三乙胺，并用磷酸调pH值为3.0）(40：60) 检测波长：484nmUVES-ES+UVES-ES+金橙II红花药材蒲黄掺伪染色的检验蒲黄掺伪染色的检验蒲黄掺伪染色的检验8 20 30 32 34 A B C D E F G 对照金胺O的薄层色谱检测硅胶G薄层板展开剂：二氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇—氨水（4：5 ：1：1）的下层溶液上：金胺O对照试剂；中34#样品（阳性样品）；下：样品E（阴性样品）金胺O的HPLC检测色谱柱：Diamonsil C18流动相：乙腈－0.025mol/L磷 酸二氢钾溶液（含0.2%三乙胺 ，并用磷酸调pH值3.0）（35 ：65）检测波长:432nm 金胺O对照试剂相应色谱峰的紫外-可见吸收光 谱蒲黄药材阳性样品相应色谱峰的紫外-可见吸收光谱金胺O对照试剂蒲黄药材中相应色谱峰中药材掺假染色检测方法研究实例n不同来源样品，多种色素或染料染色1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15硅胶G薄层板 展开剂：乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-氨水-水(1：3：3 ：1：1)五味子染色物的HPLC色谱图柱：Diamonsil C18，4.6 x 250mm 流动相：以甲醇-0.05mol/L醋酸铵梯度洗脱； 检测波长为508nm n复合色素染色 乌梅染色物：苋菜红亮蓝日落黄 硅胶GF254板，展开剂：乙酸乙酯-正丁醇-乙 醇-氨水-水（1：3：3：1：1 ）可见光检视 乌梅染色物HPLC检测Waters C18，5μm， 250 x 4.6mm；甲醇-0.02mol/L乙酸铵 （冰乙酸调pH4.0）， 梯度洗脱500nm检测苋菜红和日 落黄，630nm检测亮蓝 。
n染色物、掺伪物同时检测 血竭伪品血竭样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 显色前，可见光检视1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 显色前，紫外光灯（254nm）检视1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 显色后，可见光检视1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 显色后，紫外光灯（365nm）检视TLC检查伪品血竭中松香酸、808猩 红和苏丹红Ⅳ 血竭伪品药材HPLC分析检测Agilent C18 (4.6 X 250mm)；流动相：乙腈－水（95︰5） 阳性样品中相应色素成分峰的DAD吸收光谱 检出成分的确证样样品#色谱谱峰保留时间时间吸收峰1吸收峰2检检出大红红粉的样样 品18.1549751968.05496519大红红粉对对照 8.03496517检检出苏苏丹红红IV的 样样品219.17350518319.183505184 19.18350518519.20350518苏苏丹红红Ⅳ对对照19.13350518血竭伪品（大红粉）HPLC/MS/MS图2-羟基-3-苯胺羰基-1- 偶氮苯基-萘 m/z 368.1394 808 猩红(808 Scarlet)苏丹红IV峰的二级质谱 伪品血竭中松香酸的HPLC/MS/MS图松香酸伪品血竭检测情况样样品 编编号样样品提供或购买购买 地点TLCHPLC808 猩 红红苏苏 丹 红红 Ⅳ松 香 酸808 猩 红红苏苏 丹 红红 Ⅳ松 香 酸1安徽亳州中药药材市场场+-++-+2安徽亳州中药药材市场场-+--+-3安徽亳州中药药材市场场-++-++4重庆庆解放碑中药药材市场场-++-++5成都荷花池中药药材市场场-++-++6澳门药门药 店+-++-+已批复的中药材染色补充检验项目和检验方法品种批准件编编 号检测检测 指标标和方法蒲黄2007007金胺O薄层层色谱谱和HPLC检检 查查 黄芩片（ 饮饮片）2007008金胺O薄层层色谱谱和HPLC检检 查查红红花2007009金橙II薄层层色谱谱和HPLC检检 查查 五味子2007014胭脂红红、赤藓红藓红 和酸性红红 73薄层层色谱谱和HPLC检查检查朱砂2008003808猩红红薄层层色谱谱和HPLC 检查检查 血竭2008004808猩红红、苏苏丹红红IV和松 香酸薄层层色谱谱和HPLC检查检查乌乌梅(炙乌乌 梅)2009001苋苋菜红红、亮蓝蓝、日落黄薄 层层色谱谱和HPLC检查检查其它已批复的有关中药材掺伪等的检测方法沉香穿山甲 胆南星 海金沙 细辛 桔梗关于中药材补充检验方法研究和建立原则 的几点思考n根据中药材的质量问题，结合监管需要；n建立针对性检测指标；n检测方法适用性强：快速、简便、准确；n研究样品有代表性，覆盖面广；n格式完整规范方法验证的内容n专属性 正常药材样品的比较 HPLC/MS验证n检测限 n检测成分的结构确证 对照物对照 质谱等光 谱数据比较等n阳性样品的HPLC/MS验证补充检验方法格式n项目 [检查] 检测成分n方法描述 供试品溶液制备 对照品溶液制 备 分析检测条件 n结果判断 “应不得检出…….”“若检出…, 按……方法试验 ” 乌梅（炙乌梅） Wumei FRUCTUS MUME [检查] （1）取本品2粒，加70%乙醇20ml，超声提取20分钟，溶液颜色不得显墨绿色。
若溶液呈墨绿色，则采用下列方法检查 （2）苋菜红、亮蓝、日落黄 薄层色谱法 取本品2粒，加70%乙醇20ml，超声提取20分钟，取上清液离心，作为供试品溶液另取苋菜红、亮蓝、日落黄溶液（国家标准物质，标示浓度 0.5mg/ml，国家标准物质研究中心）各1ml，分别加70%乙醇稀释至5ml，作为 对照品溶液照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录VI D）试验，吸取供 试品溶液5μl，对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙 酯-正丁醇-乙醇-氨水-水（1：3：3：1：1）为展开剂，展开，取出，晾干供试品色谱中，在与对照品色谱的相应位置应不得检出相同颜色的斑点若检出 相同颜色的斑点，则采用下列高效液相色谱法进一步检查3）高效液相色谱法 照高效液相色谱法（中国药典2005年版一部附录VI B）测定 色谱条件与系统适用性 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为甲醇 ，流动相B为0.02mol/L醋酸铵（冰乙酸调pH4.0），梯度洗脱程序为：0-45分 钟，流动相A 20%→50%；流动相B，80%→50%检测波长500nm（检测苋 菜红和日落黄）和630nm（检测亮蓝）。
理论板数按苋菜红峰计算应不低于 4000 测定法 分别吸取[检查]（1）项下供试品溶液5μl和[检查]（2）项下对照品溶液 各2μl，注入液。