低浓度铅胁迫下不同浓度葡萄糖对小球藻生理生化的影响葸玉琴1董杰2杨梅霞3葸阳4罗亦欣5吕瑾美6(西北师范大学生命科学学院甘肃兰州730070)摘要：本实验通过测定小球藻生物量，叶绿素，胞内可溶性蛋白质和多糖的含量， 来观察适宜Pb2+浓度胁迫下不同浓度葡萄糖对小球藻生理生化的影响实验证 明，当初始藻密度为0.035g/L时，10g/L的葡萄糖浓度在经济和效益两方面都有 利于小球藻的大规模培养，在此浓度下，小球藻可溶性蛋白和多糖的单位质量浓 度分别达到了 343.06mg/g和406.05mg/g，产率分别达到了 22.58 mg.(g.d)-1和 67.68mg.(g.d)-1，具有重要的指导意义关键字：铅胁迫 可溶性蛋白质(protein)胞内多糖(polysaccharide)Abstract: this experiment through the determination of chlorella biomass, chlorophyll, soluble protein and intracellular polysaccharide content, to observe appropriate Pb 2 + concentration under stress of different concentrations of glucose on chlorella physiological and biochemical influence. Experiments show that 1 g/L glucose concentration in economic and benefits both to chlorella of mass culture, in this concentration, chlorella soluble proteins and polysaccharides unit mass concentration reached to 343.06 mg/g and 406.05 mg/g, yield reached to 22.58 mg. (g.d) - 1 and 67.68 mg. (g.d) - 1. It has important guiding significance.Keywords:Lead stress;protein;Intracellular polysaccharide小球藻(chlorella vulgaris )光合作用强，藻体中蛋白(protein)含量超过50%， 含有人类所需的20种氨基酸。
为了解决粮食问题，早在第一次世界大战期间就被 德国所注意，第二次世界大战以后更是受到各国的关注，而且小球藻细胞内多糖 (polysaccharide )也有很高的药用价值⑴已经证明小球藻热水抽提物具有促进免 疫、抗肿瘤的作用［2,3］而且适宜浓度的重金属离子有利于小球藻的生长⑷，李 师翁等⑸的实验表明，虽然小球藻体内含有大量的叶绿素，是一种光合作用很强 的微生物，但是混养更有利于小球藻的生长，其生长量是自养和异养量的总和 Pb2+是世界水体重要的重金属污染元素之一，所以研究适宜Pb2+浓度下葡萄糖对 小球藻蛋白含量和胞内多糖含量的影响，对小球藻的大规模培养和利用具有重要 的指导意义由于Pb2+在小球藻培养基中的最大允许浓度为30 mg/L⑹，而本实验采用0.4um/L的Pb2+浓度1实验材料与方法普通小球藻(chlorella vulgaris )，购自中国科学院水生生物研究所1・1实验仪器500mL三角瓶6个，超净工作台，电脑微控恒温摇床培养箱，LOZX-40BI 型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，TDL-5000B低温冷冻离心机，TGL-16M高速 台式冷冻离心机，日产日立U-1800 UV-VIS-分光光度计，JZ92-2D超声波细胞粉 碎机。
1.2试验方法1.2.1小球藻培养基采用基础培养基(SEM)⑺，配方见表1表1小球藻培养基试验编号对照组实验组ckH1H2H3H4H5培养基SEMSEMSEMSEMSEMSEMPb2+浓度(umol/L)0.40.40.40.40.40.4葡萄糖浓度(g/L)0102040801601.2.2实验条件每个三角瓶加90mL培养基，接种同一浓度的小球藻藻液10mL，总体积为 100mL在恒温摇床中培养，摇床转速为250r/min，光照度2200lx〜3000lx,温度(25 ±2) °C，光暗12 h/ 12 h，培养6天，且生长良好，满足试验要求1.2.3藻密度的测定藻密度的测定用浊度比色法⑺1.2.4光和色素含量的测定每24h取小球藻液4mL于10mL试管中，在转速为3000r/min的条件下离心 10min，去掉上清液，在每一个试管中加无水乙醇8mL，放在冰箱中提取叶绿素48h， 至藻发白用三波长比色法⑺测定叶绿素含量1.2.5小球藻细胞的破碎小球藻生长6天后，每个样取10mL藻液于离心管中在3OOOrpm转速下离心 lOmin,去掉上清液，然后再加入10mL PH7.2的PBS缓冲液洗涤，重复两次后在超 声波细胞破碎仪中进行破碎。
超声波细胞破碎仪设定为超声时间4s,间歇时间ls, 总时间lOmin破碎好的细胞液装在离心管中备用1.2.6可溶性蛋白质的测定采用考马斯亮蓝染色法测定［7,8］1.2.7细胞内多糖的含量胞内多糖含量的测定用蔥酮比色法［792实验结果分析与讨论2.1对小球藻生物量的影响二/皿=51图1适宜铅胁迫下不同葡萄糖浓对小球藻生物量的影响从图1中可以看出，对照组小球藻生长曲线平缓；而实验组中小球藻经过12h的 适应期后生长速度显著高于对照组，到达平稳期时，对照组藻密度不高于0.5g/L,而 实验组中最低藻密度也在1.5g/L,是对照组的3倍，其中H4的藻密度是对照组的5倍以 上表明混养有助于小球藻的生长，这与曹⑺等的研究结果吻合但是当葡萄糖浓 度达40g/L时，藻密度开始下降，高浓度的葡萄糖对小球藻的生长起到了抑制的作用 王素琴等［10］的研究结果表明，当葡萄糖质量浓度大于17.3 g/ L时，会抑制小球藻的 生长而Sasaki等［11 ］发现当葡萄糖浓度较低时，藻细胞浓度也低，相对高的葡萄糖 起始质量浓度（如50 g/ L）可用于培养高细胞浓度的小球藻在小球藻培养过程中所 以在小球藻的大规模培养中要根据小球藻密度的大小来添加葡萄糖，葡萄糖的加入 方式可以采用流加的方式，以避免高浓度葡萄糖对小球藻的抑制作用。
2.2对光和色素含量的影响--ck--H1 --H2 --H3--H4谥 20- 00兪 15. 00H5° 10.005. 000. 00 1 1 1 1 1 1 1 10 12 3 4 5 6 7图2适宜铅胁迫下不同葡萄糖浓对小球藻光和色素含量的影响如图2所示，对照组小球藻光和色素含量呈不断上升的趋势；而实验组小球藻细 胞光和色素含量呈先升后降的趋势对照组小球藻细胞色素在平稳期时的质量浓度 几乎是实验组的5倍而光和色素的含量直接反应光合作用的强弱［121说明小球藻适 应了含有葡萄糖的培养基之后，光合作用会减弱平稳期时，实验组细胞色素含量 是对照组的50%左右，表明在葡萄糖存在的条件下，小球藻胞内叶绿素合成受到抑 制，甚至会分解掉已经合成的光和色素;但是h4和h5的叶绿素含量高于其他实验组, 而由图1可知h4和h5的生物量含量却低于其他实验组，说明小球藻在高浓度葡萄糖 的条件下，为了维持细胞渗透压等生理指标的平衡，细胞会抑制葡萄糖的摄入而进 行原有的光合作用2.3对细胞内可溶性蛋白质含量的影响表2不同浓度葡萄糖对小球藻蛋白质含量和产率的影响分组单位质量蛋白质含量/(mg.g-1)单位体积蛋白质含量/(mg.L-1)单位体积产率(P )/[mg.(g.d)-1]ck343.06 ±19.59135.51 ±7.7422.58 ±3.76H172.47土 2.00167.63 ±5.6827.94 ±0.95H260.28 ±2.73153.88 ±6.9625.65 ±1.16H352.47± 5.27147.94 ±7.5522.88 ±2.30H438.37± 10.00104.7 ±11.0216.15 ±1.84H514.00 ±6.0421.99 ±2.093.25 ±1.58实验组各编号小球藻单位体积可溶性蛋白含量随着葡萄糖含量的增加呈现“n”型趋势。
培养基中葡萄糖浓度为10g/L、20g/L和40g/L时，其对可溶性蛋白质的含量的促进作用比较明显，其中斗和H2的产率比ck高出3%以上和严佳琦［131等的研究相 同，可以看出小球藻单位质量可溶性蛋白质含量随着培养基中葡萄糖浓度的增加而 呈下降趋势，其中对照组(ck)可溶性蛋白质含量明显高于实验各组虽然小球藻单位质量可溶性蛋白质含量会因葡萄糖而产率降低，这与李师翁⑸ 等的研究相吻合，进而说明自养小球藻可溶性蛋白质的产率更高但是葡萄糖浓度 在10g/L〜40g/L时，有利于小球藻的生长，混养条件下可溶性蛋白质单位体积含量 高于自养条件2.4对多糖含量的影响表3适宜铅胁迫下不同葡萄糖浓对小球藻多糖的影响分组单位质量多糖含量/(mg.g-1)单位质量产率(P )/[mg.(g.d)-1]ck406.05±10.2267.68 ±1.7H1294.65土 3.8449.11± 2.2H2241.83±6.7640.30 ±1.1H3161.89±6.2327.62 ±1.7H4149.10±7.7124.85 ±1.3H554.51±3.569.08 ±0.6从表中可以看出，对照组多糖的产率达到了 67.68%,而实验组小球藻胞内多糖 的产率在50%以下。
培养基中的葡萄糖含量严重抑制了细胞内多糖的产生当培养 基中有葡萄糖时，小球藻优先利用培养基中的葡萄糖，而自身细胞内多糖的产量很 少，当培养基中没有葡萄糖时，小球藻才大量合成多糖，以保证小球藻的正常代谢 小球藻所生长的环境对小球藻细胞内多糖的含量产生显著影响，这与刘⑴等的研究 结果相符与实验组细胞内多糖相比，对照组的细胞内多糖含量最多，达到了 400mg/g说明自养小球藻更有利于细胞内多糖的产生3实验总结综上所述，在小球藻的大规模培养中，培养基中葡萄糖含量为10g/L为宜在此 浓度下，虽然小球藻可溶性蛋白和多糖的单位质量浓度比自养条件下的体积浓度低， 但是由于混养条件下小球藻藻密度远大于自养条件下的藻密度，使小球藻可溶性蛋 白和多糖的单位体积浓度高于自养条件下的单位体积浓度这为小球藻的大规模培 养提供了重要的指导作用参考文献：[1 ]刘艳，杨海波，林芃，张欣华.小球藻的优化培养及胞内多糖(polysaccharide)的 提取[J].生物技术,2002.[2 ] H asegaw a T, OkudaM, Nomoto K, et a l. Augm en tat iom of th e resistance against L isteria monocytogenes by ora l adm in istration of a hotw ater extract ofCh lorella vu lgaris in m ic。