实验二氨基酸纸层析法一、实验目的1、 学习并了解分配层析的原理；2、 掌握纸层析法分离氨基酸的原理和步骤二、实验原理纸层析法（paper chromatography）是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可 用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定纸层析法是用滤纸为支持物进行层析的方 法，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和 力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相溶剂由下向上移动的，称上行法; 由上向下移动的，称下行法将样品点在滤纸上（此点称为原点），进行展层，样品中的各种 氨基酸在两相溶剂中不断进行分配由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的 速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf 原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离在一定条件下某种物质的Rf值是常数Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、 温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变， Rf值是常数，故可根据Rf值作定性判断样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展 层，就不能将它们分开。
为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展 层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用三、药品器材1实验器材混合氨基酸溶液（蛋清或血清水解后的氨基酸干粉）6mg/ml、滤纸、烧杯10ml（X1）、剪刀、层析缸（X2）、微量注射器10（X1）或毛细血管、电吹风（XI）、722型（或7220型）分光光度计2实验试剂 __⑴溶剂系统 （广碱相溶剂：V[正丁醇（A.R.） ]:V（12%氨水）:V（95%乙醇）=13:3:3酸性溶剂：V[正丁醇（A.R.） ]:V（80% 甲酸）:V（水）=15:3:2（2）显色贮备液:V（0.4mol/茚三酮-异丙醇）:V（甲酸）:V（水）=20:1:5⑶V（0.1%硫酸铜:V（75%乙醇）=2:38溶液，现配现用四、实验方法1. 滤纸准备：选用新华1号滤纸，裁成24cmX28cm的长方形，在距纸一端2cm处用铅 笔轻轻划一基线，上每隔3cm，画一小点样的原点2. 点样：用毛细管吸取少量氨基酸样品点于原点（分批点完），用吹风机稍加吹干后再点 下一次，重复3次，点子直径不能超过0.5cm。
3. 展层：将点好样的滤纸，用白线缝好，制成圆筒，原点在下端，浸立在培养皿内，不需平衡，立即展层展层剂为酸性溶剂系统［V（正丁醇）：V（甲酸）：V（水）=15:3:2］， 把展层剂混匀，倒入培养皿内，同时加入显色贮备液:每10ml展层剂加0.1-0.5ml的显 色贮备液）进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿1-2cm时4. 显色：展层毕，取出滤纸，用热风吹干，蓝紫色斑点即显现5. 结果：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之 间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的Rf值，与标准氨基酸的Rf值对 照，确定混合物中含有哪些氨基酸五、实验结果由层析滤纸图可得：溶剂前沿距原点8.57m单一氨基酸溶液各自的Rf值脯氨酸的 Rf 值=3.37/8.57=0.393缬氨酸的 Rf 值=5.31/8.57=0.620苏氨酸的 Rf 值=2.45/8.57=0.286赖氨酸的 Rf 值=1.30/8.57=0.152氨基酸混合液中各氨基酸的Rf值成分 1 的 Rf 值=3.51/8.57=0.409成分 2 的 Rf 值=6.00/8.57=0.642成分 3 的 Rf 值=3.29/8.57=0.248成分 4 的 Rf 值=1.69/8.57=0.141根据混合样品的Rf值与标准氨基酸Rf值的比较可以判断混合样品中成分1为脯氨酸， 成分2为缬氨酸，成分3为苏氨酸，成分4为赖氨酸。
七、思考题1. 纸层析法的原理是什么？答：纸层析法又称纸色谱法以纸为载体的色谱法固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流 动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等 将试样点在纸条的一端，然后在密闭的槽中用适宜溶剂进行展开当组分移动一定距离后， 各组分移动距离不同，最后形成互相分离的斑点将纸取出，待溶剂挥发后，用显色剂或其 他适宜方法确定斑点位置根据组分移动距离（Rf值）与已知样比较，进行定性用斑点 扫描仪或将组分点取下，以溶剂溶出组分，用适宜方法定量（如光度法、比色法等）在环 境分析测试中，有时用纸层析法分离试样组分，它用于一些精度不高的分析2. 何谓Rf值？影响Rf值的主要因素和注意事项？答：Rf原点到层析斑点中心的距离原点到溶剂前沿的距离Rf值是指溶质在滤纸上的移动速率影响Rf值的主要因素是溶质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号 和质量等因素只要条件（如温度、展层溶剂的组成）不变，溶质的Rf值是常数注意事项1. 点样点的直径不能大于0.5cm，否则分离效果不好，并且样品用量大，会造成“拖尾巴” 现象2. 在滤纸的一端用点样器点上样品，点样点（原点）要高于培养皿中扩展剂液面约1cm。
由 于各氨基酸在流动相（有机溶剂）和固定相（滤纸吸附的水）的分配系数不同，当扩展剂从 滤纸一端向另一端展开时，对样品中各组分进行了连续的抽提，从而使混合物中的各组 分分离3. 取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；如条 件许可，也可戴上一次性手套拿滤纸要将滤纸平放在洁净的滤纸上，不可放在实验台 上，以防止污染。