冰冻切片组织的制备:固定 将组织置于 4%多聚甲醛固定液中， 4℃摇床过夜漂洗 将固定后的标本用 1X PBS 漂洗三次，每次 15 分钟脱水 将组织置于 30%蔗糖溶液中， 4℃摇床过夜第二天观察是否脱水完全，判断的标准是，当管竖直时，组织是否沉到蔗糖溶液的底部，若组织已完全沉降到蔗糖溶液的底部，平放或震荡后仍能沉降，则可判断组织已脱水完全包埋 将组织倒入培养皿中，用眼科刀将脑和脊髓根据切片切面的需要在不同的部位切开，并做好头尾端的标记之后将组织置于包埋盒中，用滤纸吸干组织周围多余的蔗糖溶液，滴加 OCT（optimal cutting temperature compound）到包埋盒中，用移液枪头小心的将组织周围的 O.C.T 混匀，切忌起气泡，静止 10 分钟，以防切片时脱片重新取一个包埋盒，将组织移入到包埋盒中，倒入 OCT，再次用移液枪头将组织与O.C.T 混匀，将组织按切片需要方向摆放于包埋盒的底部，迅速置于干冰与酒精的混合物中在包埋盒上做好标记，用保鲜膜和锡纸包好后放入-80℃冰箱贮藏待切切片：切片前先将切片机的箱体温度及刀头温度均设为-20℃，把包埋盒从-80 ℃冰箱取出置于切片机中平衡半小时左右。
之后将包埋块用 O.C.T 固定在样品托上，然后将样品托固定在样品头上，调整合适的位置，以使样品与刀头处于平行位置手动切片用细毛笔将切片均匀整齐地平铺在明胶包被的载玻片上，室温下晾片 30min-1h 后进行免疫组化染色冰冻切片的快速染色法冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定 1 分钟后即可染色以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存 方法： 1. 切片固定 1 分钟 2. 水洗（肉眼观察，洗净即可） 3. 染苏木素 5 分钟 4. 1%盐酸酒精分化 5. 于碱水中返蓝 10 秒 6. 伊红染色 10 秒 7. 脱水，透明，中性树胶封固 冰冻组织 1－2 分钟，切片 1 分钟，固定 1 分钟，染色共五分钟总共在 10 分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。
冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述 冰冻切片免疫组织化学染色：晾片 将贴有组织的载玻片在空气中晾干，约30min-1h ； ○1②漂洗 在1X PBS中漂洗3次，每次15 min PHT室温下孵育30 min； ③一抗孵育 将切片放在湿盒内，用滤纸吸干玻片上多余的水分，滴加 200μl 一抗工作液，盖好封口膜，4℃ 孵育过夜，约 18h-24h；④漂洗 在 1X PBS 中漂洗 3 次，每次 15min； ⑤二抗孵育 用滤纸吸干玻片上多余的水分，滴加 200μl 二抗工作液，盖好封口膜，4℃孵育过夜； ⑥漂洗 在 1X PBS 中避光漂洗 3 次，每次 15min； ⑦封片 滴加 Vectashield 防荧光淬灭封片剂在盖玻片上，反转盖玻片，倾斜 45°角轻轻放下盖玻片，待封片剂均匀地填充在盖玻片和载玻片之间后用指甲油封固盖玻片四周，指甲油晾干后在荧光显微镜下观察结果封好的片子在 4℃避光保存或者可先在荧光显微镜下观察结果，再用指甲油封片操 作 方 法 及 步 骤① 取 材 ， 未 能 固 定 的 组 织 取 材 ， 不 能 太 大 太 厚 ， 厚 者 冰 冻 费 时 ， 大 者 难 以 切 完 整 ，最 好 为 24×24×2mm。
② 取 出 组 织 支 承 器 ， 放 平 摆 好 组 织 ， 周 边 滴 上 包 埋 剂 ， 速 放 于 冷 冻 台 上 ， 冰 冻 小组 织 的 应 先 取 一 支 承 器 ， 滴 上 包 埋 剂 让 其 冷 冻 ， 形 成 一 个 小 台 后 ， 再 放 上 细 小 组 织 ，滴 上 包 埋 剂 ③ 将 冷 冻 好 的 组 织 块 ， 夹 紧 于 切 片 机 持 承 器 上 ， 启 动 粗 进 退 键 ， 转 动 旋 钮 ， 将 组织 修 平 ④ 调 好 欲 切 的 厚 度 ， 根 据 不 同 的 组 织 而 定 ， 原 则 上 是 细 胞 密 集 的 薄 切 ， 纤 维 多 细胞 稀 的 可 稍 为 厚 切 ， 一 般 在 5～ 10um 间 ⑤ 调 好 防 卷 板 制 作 冰 冻 切 片 ， 关 键 在 于 防 卷 板 的 调 节 上 ， 这 就 要 求 操 作 者 要 细 心 ，准 确 地 将 其 调 较 好 ， 调 校 至 适 当 的 位 置 切 片 时 ， 切 出 的 切 片 能 在 第 一 时 间 顺 利 地通 过 刀 防 卷 板 间 的 通 道 ， 平 整 地 躺 在 持 刀 器 的 铁 板 上 。
这 时 便 可 掀 起 防 卷 板 ， 取 一载 玻 片 ， 将 其 附 贴 上 即 可 ⑥ 应 视 不 同 的 组 织 选 择 不 同 的 冷 冻 度 冷 冻 箱 中 冷 冻 度 的 高 低 ， 主 要 根 据 不 同 的 组织 而 定 ， 不 能 一 概 而 论 如 ： 切 未 经 固 定 的 脑 组 织 ， 肝 组 织 和 淋 巴 结 时 ， 冷 冻 箱 中 的 温度 不 能 调 太 低 ， 在 -10- -15℃ 左 右 ， 切 甲 状 腺 、 脾 、 肾 、 肌 肉 等 组 织 时 ， 可 调 在 -15～ 20℃ 左 右 ， 切 带 脂 肪 的 组 织 时 ， 应 调 至 -25℃ 左 右 ， 切 含 大 量 的 脂 肪 时 ， 应 调 至 -30℃ 冰 冻 切 片 时 的 注 意 事 项① 防 卷 板 及 切 片 刀 和 持 刀 架 上 的 板 块 应 保 持 干 净 ， 需 经 常 用 毛 笔 挑 除 切 片 残 余和 用 柔 软 的 纸 张 擦 有 时 需 要 每 切 完 一 张 切 片 后 就 用 纸 擦 一 次 因 为 这 个 地 方 是 切 片 通过 和 附 贴 的 地 方 ， 如 果 有 残 余 的 包 埋 剂 粘 于 刀 或 板 上 ， 将 会 破 坏 甚 至 撕 裂 切 片 ， 便 切 片不 能 完 整 切 出 。
② 多 例 多 块 组 织 同 时 需 做 冰 冻 切 片 时 ， 可 各 自 放 于 不 同 的 支 承 器 上 ， 于 冷 冻 台 上冻 起 来 ， 然 后 依 据 不 同 的 编 号 ， 依 序 切 片 ， 这 样 做 既 不 费 时 也 不 会 乱 ③ 放 置 组 织 冰 冻 前 ， 应 视 组 织 的 形 状 及 走 势 来 放 置 ， 所 谓 “砍 柴 看 柴 势 ”， 切 片 也是 如 此 ， 如 果 胡 乱 放 置 ， 就 不 能 收 到 很 好 的 效 果 ④ 组 织 块 不 须 经 各 种 固 定 液 固 定 ， 尤 其 是 含 水 的 固 定 液 ， 在 未 达 到 固 定 前 ， 更 不 能使 用 临 床 快 速 冰 冻 切 片 ， 不 须 要 预 先 固 定 ， 一 是 为 了 争 取 时 间 ， 二 是 固 定 了 的 组 织 ，反 而 增 加 了 切 片 的 难 度 如 果 使 用 未 完 全 固 定 的 组 织 做 冰 冻 切 片 ， 就 会 出 现 冰 晶 这是 因 为 含 水 的 固 定 液 在 组 织 未 经 固 定 前 ， 其 中 的 水 份 也 可 渗 入 到 组 织 中 去 ， 当 冰 冻 发生 时 ， 这 些 水 份 就 存 留 于 组 织 中 ， 形 成 了 冰 晶 。
⑤ 当 切 片 时 ， 如 果 发 现 冰 冻 过 度 时 ， 可 将 冰 冻 的 组 织 连 同 支 承 器 取 出 来 ， 在 室 温 停留 片 刻 ， 再 行 切 片 ， 或 者 用 口 中 哈 气 ， 或 者 用 大 拇 指 按 压 组 织 块 ， 以 此 来 软 化 组 织 ， 再行 切 片 另 者 ， 调 高 冰 冻 点 ⑥ 用 于 附 贴 切 片 的 载 玻 片 ， 不 能 存 放 于 冷 冻 处 ， 于 室 温 存 放 即 可 因 为 当 附 贴 切 片时 ， 从 室 温 中 取 出 的 载 玻 片 与 冷 冻 箱 中 的 切 片 有 一 种 温 度 差 ， 当 温 度 较 高 的 载 玻 片 附 贴上 温 度 较 低 的 切 片 时 ， 由 于 两 种 物 质 间 温 度 的 差 别 ， 当 它 们 碰 撞 在 一 起 时 ， 分 子 彼 此 间发 生 转 移 而 产 生 了 一 种 吸 附 力 ， 使 切 片 与 载 玻 片 牢 固 地 附 贴 在 一 起 如 果 使 用 冷 藏 的 载玻 片 来 附 贴 切 片 ， 由 于 温 度 相 同 ， 没 有 发 生 上 述 的 现 象 。