SNP-STR遗传标记复合扩增体系的筛选构建及在法医学中的应用SNP-STR遗传标记是由短串联重复序列位点与其相邻的单核苷酸多态性组成的单倍型在STR位点的侧翼序列中存在SNP，可以利用等位基因特异性聚合酶链反应（allele-specificpolymerasechainreaction,ASPCR）技术，又称扩增受阻突变系统（amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)[1]，实现SNP和STR等位基因的同步检测其原理是针对STR重复结构侧翼序列中的SNP等位基因设计引物，将SNP所在的位置设置在引物3′端的3个碱基内，并通过在其两侧人为引入错配碱基使得引物与不同SNP等位基因的结合能力存在差异，从而实现对其中一种SNP等位基因的选择性扩增ASPCR可在上千个细胞中检测出具有序列突变的细胞[2]，在肿瘤细胞异质性[3]、母体外周血游离胎儿DNA分析[4]、亲子鉴定[5]以及混合DNA分析[6,7,8]等方面都有着广泛的应用价值混合DNA分析是法医遗传学领域的难题之一在现行法医DNA分析体系中，以毛细管电泳为基础的STR图谱解析和似然率计算仍然是混合DNA分析的主要方法。
在法医DNA样品中，两个体DNA混合是出现频率最高的混合类型，其中，量较大的个体DNA称为多数成分，量较少称为少数成分多数成分与少数成分的比值称为混合比例（mixtureratio）现行STR复合扩增体系在进行混合DNA分析时，其分析准确度主要受到混合DNA构成个体数以及混合比例的影响一般而言，混合个体数越多、混合比例越大，则混合DNA的STR图谱解析难度越大当混合比例超过10∶1时，少数成分的等位基因很难被检出或容易出现等位基因丢失的现象[9]基于ASPCR技术复合扩增SNP-STR[10]、SNP-SNP[11]、插入缺失多态性（deletion/insertionpolymorphism,DIP)-STR[12]遗传标记的方法可以提高混合DNA的分析效能这是因为，当混合DNA样本中少数成分与多数成分的SNP或插入/缺失（insertion/deletion,InDel）等位基因不同时，可以通过SNP或InDel等位基因特异性扩增少数成分所特有的STR等位基因，从而避免多数成分对少数成分的竞争性扩增抑制，进而提高对混合DNA的分析效能这种在少数成分与多数成分之间存在差异的SNP-STR或DIP-STR遗传标记又被称为信息遗传标记（informativemarker）。
之前的研究结果也验证了这一方法的有效性，WEI等[6]以及TAN等[7]分别构建了由8个和11个SNP-STR遗传标记构成的复合扩增体系来进行混合样本的分析，混合比例最高分别为20∶1和100∶1时，仍能得到信息遗传标记的完整分型同时，WEI等[6]在观察单位点扩增时，混合比例最高可达1000∶1基于SNP-STR遗传标记在混合DNA分析中所具有的潜在优势，本研究将进一步探究SNP-STR遗传标记在法医DNA分析中的应用效能SNP-STR遗传标记由于结合了SNP和STR的优势，能够利用少数成分所特有的SNP等位基因进行混合DNA的区分，以及使用STR等位基因在毛细管平台上进行分型[7]因此，为增加其实际应用能力，本研究将在商业化试剂盒所使用的STR中筛选SNP-STR遗传标记，因为这些STR基因型信息与现有的规模化STR数据库兼容其次，对于两个体DNA混合样本，SNP-STR遗传标记中出现的信息基因型概率[12]主要取决于SNP基因座因此，本研究选择STR基因座重复结构两侧300个碱基范围内、最小等位基因频率大于0.1的SNP位点组成SNP-STR遗传标记，构建SNP-STR遗传标记复合扩增体系。
在设计SNP等位基因特异性引物时，较此前研究使用“分别在引物3′端第二或第三位设计错配碱基”[6]或者“一强一稍弱”[7]的方法有所区别，本研究均在引物3′端的第三位碱基引入抑制引物-模板结合效果最强的错配碱基为探究该体系的法医学效能，本研究利用四川汉族群体进行该体系的法医遗传学参数分析此外，通过不同位点数量的复合扩增体系对不同混合比例的两个体DNA混合样本进行分析，探讨SNP-STR遗传标记复合扩增体系在混合DNA分析中的应用能力1、材料与方法1.1样本采集根据知情同意原则，采集103名四川汉族无关健康个体的乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA）抗凝外周血样，置于-20℃保存备用1.2DNA提取及定量采用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取血液DNA，具体方法参照试剂盒说明书采用InvestigatorQuantiplex试剂盒（德国Qiagen公司）对提取的DNA进行精确定量，具体方法参照试剂盒说明书1.3SNP-STR遗传标记筛选为增加本研究所构建体系与现有法医STR数据库的兼容性，本研究主要以商业化试剂盒中的STR基因座为待选位点，包括PowerPlex21试剂盒（美国Promega公司）、InvestigatorIDplexPlus试剂盒（德国Qiagen公司）、EX22试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）、AGCU21+1荧光检测试剂盒（无锡中德美联生物技术有限公司）、MicroreaderTM23spIDSystem（北京阅微基因技术有限公司）。
SNP位点的筛选使用基于UnixShell语言的VCFtools脚本[13,14]在1000Genomes数据库[15]中完成，其筛选原则为：（1)SNP与STR重复结构的距离小于300bp;(2)SNP位点在中国汉族群体中的最小等位基因频率大于0.1;(3)SNP位点在中国汉族群体中为二等位基因1.4等位基因特异性引物设计利用Primer3进行引物设计（http://primer3.ut.ee/）根据SNP位点设计相应的特异性扩增引物，引物3′端为SNP位点，每个SNP位点设计两条不同碱基末端的引物为保证引物的扩增特异性，参照HUANG等[16]提出的错配碱基设计原则，在引物的3′端第三位碱基处设计错配碱基引物长度为18～39bp,GC含量为20%～60%，解链温度（meltingtemperature,Tm）为55～59℃，如果在扩增中观察到加A不全的现象，则在引物的5′端重新添加非人类基因组的特殊序列（GTTCTT)n利用美国国立生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI）上的Primer-BLAST工具检测引物特异性。
具体引物序列如表1～2所示1.5引物特异性验证对于每一SNP-STR遗传标记均设计两对引物，其中3′端分别针对SNP位点的2个等位基因，5′端为相同的通用引物每一SNP-STR遗传标记进行单位点扩增，并设置3个退火温度（51℃、54℃、57℃）来优化复合扩增体系反应体系为：2×PremixTaqDNA聚合酶（日本TaKaRa公司）5μL,10μmol/L等位基因特异性引物0.5μL,10μmol/L通用引物0.5μL，模板DNA1ng，无核酸酶水3μLPCR循环条件为：95℃预变性2min;95℃变性30s,51℃（或54℃和57℃）复性30s,72℃延伸30s，共35个循环；终延伸72℃5min扩增片段采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）及银染进行分型检测表113个SNP-STR遗传标记的引物信息（PanelA)表213个SNP-STR遗传标记的引物信息（PanelB)利用Sanger测序验证电泳分型结果利用Primer3对SNP-STR遗传标记设计Sanger测序引物，使其扩增产物将SNP和STR位点均包括在内，在长度上较SNP-STR等位基因特异性扩增产物更长。
对于扩增片段过小（150bp左右）的引物对，在引物的5′端加上M13序列（F:TGTAAAACGACGGCCAGT;R:CAGGAAACAGCTATGACC）使用新设计的测序引物或M13引物进行测序，测序工作由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成测序引物序列见表3表3测序引物序列信息1.6复合扩增体系及分析方法的建立为尽可能减少引物间相互作用对复合扩增体系扩增效能的影响，本研究利用AutoDimer软件[17]对上述所有等位基因特异性引物和通用引物的引物间相互作用进行分析，根据分析结果对引物序列进行调整经过筛选和调整，共得到13个SNP-STR遗传标记的26条等位基因特异性引物，并与13条各位点相应的通用引物共同构成26对等位基因特异性扩增引物，分成A和B两个复合扩增体系复合扩增反应体系为：2×MultiplexPCRMasterMix（德国Qiagen公司）5μL,PrimerMix1μL，模板DNA1ng，无核酸酶水3μLPCR扩增条件为：95℃预变性15min；巢式扩增12个循环，包括95℃变性30s,57～51℃（每个循环降0.5℃）复性90s,72℃延伸30s;20个循环扩增，包括95℃变性30s,57℃复性90s,72℃延伸30s；终延伸72℃60min。
扩增产物在3130基因分析仪（美国ThermoFisherScientific公司）上进行毛细管电泳分离和基因型判读总电泳体系为10μL，包括1μL扩增产物，8.9μL去离子甲酰胺，0.1μL内标AGCUMarkerSIZ500（无锡中德美联生物技术有限公司）电泳介质为POP-7分离胶（美国ThermoFisherScientific公司），毛细管长36cm，进样电压3kV，进样时间8s，电泳电压9kV，时间30min采用GeneMapperTMIDv3.2软件（美国ThermoFisherScientific公司）进行基因分型根据2800M标准品DNA以及已通过测序得到确定SNP-STR基因型分型的样本的电泳结果，获得各位点不同等位基因的电泳迁移参数，编写相应的panel文件和bin文件，建立等位基因分型标准品（ladder）1.7群体遗传学参数分析采用该体系对103例四川汉族个体样本进行基因分型使用Arlequin3.11软件对SNP-STR遗传标记进行Hardy-Weinberg平衡以及连锁不平衡（linkagedisequilibrium,LD）检验根据分型结果，统计SNP-STR单倍型数目以及不同SNP等位基因的单倍型数量和频率。
使用PowerStatsv12软件计算个体识别率（discriminationpower,DP）、观察杂合度（observedheterozygosity,Ho）、典型父权指数（typicalpaternityindex,TPI）以及非父排除率（probabilityofpaternityexclusion,PE）依据CASTELLA等[12]论文中的公式，计算信息基因型概率同时，比较SNP-STR遗传标记复合扩增体系与相应STR基因座复合扩增体系的群体遗传学参数，包括累积个体识别率（cumulativediscriminationpower,CDP）、累积父权指数（combinedpaternityindex,CPI）、累积非父排除率（cumulativeprobabilityofexclusion,CPE）以及平均观察杂合度1.8SNP-STR遗传标记复合扩增体系的混合样本检测能力分析1.8.1单位点等位基因特异性扩增为明确单个SNP-STR遗传标记对混合样本DNA的分析能力，本研究使用已知SNP-STR分型的DNA样品进行混合，混合比例为1000∶1，其中少数成分DNA量为100pg。
1.8.2复合扩增体系对混合样本的检测为明确复合扩增体。