N6-甲基腺苷调控细胞自噬的潜在机制心血管疾病死亡的主要原因是急性心肌梗死经皮冠状动脉介入术、药物溶栓、冠状动脉旁路移植术等可缩小急性心肌梗死面积,是保护濒临死亡心肌的最有效方法但血管再通与血流恢复引起血管内皮细胞功能异常及炎性因子激活,加剧了细胞死亡,可导致心肌缺血再灌注损伤[1]远端缺血预适应可减轻心肌缺血再灌注损伤[2],多种治疗方法靶向心肌缺血再灌注损伤可能更有益自噬广泛存在于真核细胞内,对维持细胞存活,物质再利用和内环境稳态有重要作用[3]自噬参与心肌缺血再灌注损伤的病理过程,但其分子机制尚未完全明确研究[4]证实,真核生物信使RNA(messengerRNA,mRNA)修饰是一种新的表观遗传调控方式,最常见的修饰包括N6腺苷碱基的甲基化即N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)、5-甲基胞嘧啶羟基化、N1-甲基腺苷等m6A修饰的潜在调节作用可能影响多种心血管疾病的发生、发展[5]本文就m6A修饰调控细胞自噬、参与心肌缺血再灌注损伤的潜在机制的研究进展综述如下1、心肌缺血再灌注损伤的可能机制心肌缺血再灌注损伤是指心肌恢复血流灌注后,结构和功能未能恢复,并产生更严重的损伤,其发生与氧化应激、炎性反应、细胞内钙超载和线粒体功能障碍以及细胞自噬有关。
1.1氧化应激在缺血缺氧的氧化应激状态下,细胞内代谢紊乱,氧自由基清除能力不足,而再灌注时,可经线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶等途径产生大量活性氧自由基产生后可损伤细胞膜结构,使细胞膜失去正常屏障功能,通透性增加,细胞内外的物质顺浓度流动,细胞失去正常功能;自由基还可通过氧化破坏机体蛋白,改变蛋白酶表面结构使其失去功能;自由基可致遗传物质DNA、RNA断裂,核酸失去正常功能,最后导致细胞凋亡,从而引起心肌损伤1.2细胞内和线粒体钙超载正常情况下,细胞外Ca2+浓度高于细胞内,钙泵将细胞内多余的Ca2+转运至细胞外,保持细胞内合理的钙浓度心肌发生缺血和再灌注损伤时,心肌细胞膜结构损伤,细胞膜通透性增加,细胞外Ca2+顺浓度梯度进入细胞内;同时,三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,ATP)生成减少或缺乏,使钙泵失活,不能及时泵出Ca2+;组织缺血缺氧导致细胞内pH值下降,细胞膜Na+/H+交换泵、Na+/Ca2+离子泵作用增强,使细胞内H+浓度降低、Ca2+浓度升高钙超载可引起线粒体膜通透性转换孔开放,线粒体膜电位异常,促进凋亡因子释放,激活钙蛋白酶,促进炎性反应发生。
1.3线粒体功能障碍线粒体是细胞内产生能量的主要场所在心肌缺血再灌注过程中,线粒体钙超载和大量活性氧产生均可导致线粒体损伤线粒体通透性转换孔是位于线粒体内外膜上的一种非特异性通道,缺血期间保持关闭状态,再灌注时保持开放状态钙超载可引起线粒体膜通透性转换孔开放,线粒体膜电位异常,进一步导致ATP合成受损,活性氧产生,线粒体水肿,外膜破裂,促进细胞色素C和凋亡因子释放,最终导致细胞死亡1.4炎性反应炎性反应是心肌缺血再灌注损伤的另一个重要因素,涉及先天性和适应性免疫反应的募集和激活,并导致心肌损伤1.5细胞自噬细胞自噬指囊泡包被细胞质中线粒体等细胞器,形成双层膜结构自噬体,与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物进行细胞代谢和更新一般哺乳动物细胞自噬分为3类[3]:(1)大自噬/宏自噬:细胞质中可溶性大分子物质、变形细胞器可被内质网、线粒体来源的单层或双层膜包裹形成自噬体,随后与溶酶体融合为自噬溶酶体,以内含的水解酶降解相应底物来完成自噬此过程是自噬的典型过程2)小自噬/微自噬:该过程并不会形成自噬体,而是溶酶体膜自身发生内陷,直接包裹和吞噬细胞内待降解的底物,并在溶酶体内发生降解。
3)分子伴侣介导的自噬:分子伴侣蛋白识别并结合带有特定氨基酸序列的可溶性蛋白质,再经溶酶体膜上的受体Lamp2a转运至溶酶体内被水解酶降解,但在降解蛋白时具有选择性自噬的形成过程包括自噬诱导、囊泡形成、囊泡延伸、成熟等阶段自噬机制的受损与心血管疾病、神经退行性疾病以及肿瘤等密切相关自噬对心肌缺血和再灌注两个阶段具有双向调节作用心肌缺血时,ATP浓度降低,一磷酸腺苷(adenosinemonophosphate,AMP)/ATP比例增高,可激活AMP依赖的蛋白激酶(adenosine5'-monophosphate-activatedproteinkinase,AMPK),对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin,mTOR)复合物mTORC1产生抑制作用,导致与其结合的自噬蛋白unc-51样激酶(unc-51likeautophagyactivatingkinase,ULK)1复合物释放,即经AMPK-mTORC1-ULK1途径激活自噬,产生ATP应对能量危机,对心肌细胞发挥保护作用;在再灌注阶段,活性氧爆发导致自噬相关蛋白Beclin-1上调,刺激自噬从而加重心肌细胞的损伤[6]。
2、m6A修饰哺乳动物中可检测到7000个左右基因发生m6A,m6A修饰包含在共有序列5'-RRACH-3'(R=A或G;H=A,C,orU)中,且这些位点主要分布在终止密码子附近以及3'UTRm6A可调节多种类型细胞的生长,与人类肿瘤及心血管疾病等有关[7]m6A修饰过程主要涉及3类催化酶:(1)甲基化转移酶:包括甲基转移酶样(methyltransferase-like,METTL)3、METTL14、Wilms肿瘤蛋白-1相关蛋白(Wilmstumor1-associatedprotein,WTAP)、KIAA1429(VIRMA/VIRILIZER)和NA结合基序蛋白15METTL3、METTL14、WTAP构成催化m6A甲基化的甲基转移酶复合物核心成分,其中METTL3具有催化亚基活性,METTL14充当METTL3的结构支持,WTAP稳定核心复合物NA结合基序蛋白15有助于将复合物募集到其靶位[8]目前KIAA1429的分子功能尚不明确2)去甲基化酶:包括α-酮戊二酸依赖性双加氧酶同系物5(α-ketoglutarate-dependentdioxygenasealkBhomolog5,ALKBH5)、脂肪量和肥胖相关蛋白(fatmassandobesityassociatedprotein,FTO)。
FTO是哺乳动物中发现的第1个去甲基化酶,ALKBH5影响mRNA的输出和RNA代谢及加工[7]3)甲基化识别酶:包括核不均一YTH结构域蛋白,核糖核蛋白以及胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白等其中YTH结构域蛋白包括YTHDC1/2和YTHDF1/2/3甲基化识别酶可识别发生m6A修饰的碱基,参与下游mRNA翻译、降解及微小RNA的加工[9]3、m6A修饰与心脏功能调控心肌缺血再灌注损伤导致心肌细胞水肿、出血、坏死,发生心肌肥大重塑,影响心脏舒缩功能,最终导致心力衰竭和心律失常m6A修饰为基因转录后调控的发展提供了新的视野Preissl等[10]通过分析心脏不同类型细胞特异性核mRNA和表观遗传修饰,揭示了心肌细胞中基因表达调控的表观遗传机制3.1m6A与心肌缺血Saxena等[11]提出,m6A可影响mRNA的半衰期,导致心脏保护性蛋白表达,从而缩小缺血心肌梗死面积,将m6A引入心脏保护领域有研究[12]检测心肌梗死患者和正常对照者心肌组织METTL3基因的表达,发现与正常对照者心肌组织相比,心肌梗死患者心肌组织METTL3表达上调研究[13]表明,ALKBH5过表达可逆转心肌缺血再灌注损伤,提示m6A在缺血性心脏病中的重要性。
此外,Fto过表达心肌梗死小鼠心肌纤维化减轻,新生血管生成增多,说明Fto过表达可调节m6A水平并改善心肌梗死后的心功能[13]3.2m6A与心肌肥大增强m6A水平导致代偿性心肌肥大,减少m6A导致离心性心肌细胞重构和功能障碍[14],表明METTL3控制心肌细胞中的基因表达,调节心脏重塑和功能3.3m6A与心力衰竭Mathiyalagan等[13]研究发现,在心力衰竭哺乳动物的心脏中FTO表达降低,增加收缩转录本SERCA2a和RYR2中m6A水平,引起异常钙稳态并降低心脏收缩功能,表明FTO在心力衰竭期间心脏收缩功能维持中发挥了重要作用Berulava等[15]报道,m6A可影响RNA翻译和蛋白质产生,并参与心力衰竭的进展3.4m6A与心律失常FTO与多种心脏缺陷有关,包括肥厚性心肌病,室间隔缺损、心律失常等Carnevali等[16]研究发现,小鼠FTO缺乏可导致心脏的交感神经调节失衡,电生理性和结构特性紊乱,发生心律失常3.5m6A与高血压m6A在血压调节中起重要作用Su等[17]研究了缺氧性肺动脉高压中m6AcircRNA的转录组全图,确定了影响缺氧性肺动脉高压circRNA-miRNA-mRNA共表达网络的m6A水平。
通过METTL3和FTO靶向调节m6A可能作为高血压和心血管疾病的潜在诊断方法和治疗方法[18]心脏修复与再生治疗是临床研究的重点[19],m6AmRNA甲基化调控心脏基因表达和细胞生长[20],为心肌缺血再灌注损伤后改善心脏功能和心肌修复再生提供新概念4、m6A调控自噬m6A通过调节细胞自噬,在癌症、生殖及心血管系统等方面发挥重要作用4.1自噬诱导阶段mTOR是自噬诱导过程中的关键分子,激活mTOR的通路如磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)-1/Akt和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)/Erk信号通路可抑制自噬,负调控mTOR的通路如AMPK和p53信号通路可促进自噬哺乳动物自噬发生主要受ULK复合物调控,该复合物包括ULK1/2、ATG13、ATG101、FIP200[21]正常情况下,AMPK失活,mTORC1与ULK1/2相互作用并使其失活;当缺血缺氧或其他刺激时,AMPK活化,mTOR失活,激活ULK1/2使ATG13、ATG101和TIP200磷酸化,从而启动自噬。
FTO与mTORC1的活性相关,FTO缺乏可减少mTORC1通路的激活,降低mRNA的翻译率,增加自噬[22]研究[23]发现,FTO靶向ULK1转录物上的m6A位点催化脱甲基化并调控ULK1蛋白丰度,且FTO不影响ULK1mRNA自细胞核至细胞质的转运mTOR是心肌缺血阶段调控自噬的核心蛋白,通过抑制mTOR激活自噬缓解心肌缺血再灌注损伤因此,FTO-mTORC1轴的激活是否通过抑制自噬参与心肌缺血再灌注损伤尚待阐明低氧诱导因子1是一种核转录因子,在缺氧/复氧条件下其转录水平和蛋白表达明显提高,并促进缺氧引起的自噬诱导,减轻缺氧诱导心肌损伤[24]FTO表达在低氧胁迫下受到调节,了解FTO是否影响低氧诱导因子1及其下游靶基因有重要意义[25]在缺氧条件下,低氧诱导因子1α通过与启动子相互作用而提高了ALKBH5的表达[26]在心肌缺血再灌注损伤中,低氧诱导因子1是否通过调节ALKBH5影响m6A从而调控心脏功能有待进一步研究4.2囊泡成核阶段由hVps34、Beclin-1、p150和ATG14或抗紫外线照射相关基因组成的Ⅲ型PI3K复合物的激活触发初始自噬膜形成,形成具有双层膜杯状分隔膜的自噬前体[21]。
哺乳动物中,自噬相关蛋白Beclin-1与B淋巴细胞瘤-2(B-celllumphoma-2,Bcl-2)相互作用并抑制自噬,而自噬作用的触发则需Beclin-1从Bcl-2上解离下来上皮性卵巢癌组织中m6A去甲基化酶ALKBH5表达增加,促进Bcl-2和Beclin-1之间的相互作用并抑制自。