五灵胶囊对LPS诱导枯否细胞释放细胞因子的影响_医学论文 作者：王胜春，张英志，胡咏武，李晓玮，田卫斌 【关键词】 ,五灵胶囊 【Abstract】 AIM: To investigate the effects of WuLing Capsules on liver cell injuries induced by active molecules secreted by Kupffer’s cells. METHODS: Hepatocyte and Kupffer’s cells were isolated and purified from rat livers and then exposed to LPS and DGlan. The changes of hepatocytes and cytokines secreted from Kupffer’s cells were determined in the presence of WuLing Capsules. The protective effects of WuLing Capsule on hepatocyte injuries induced by LPS stimulation of kupffer’s cells were also examined. RESULTS: WuLing Capsules significantly reduced hepatocyte injuries induced by LPS and DGlan exposure and inhibited TNFα, IL6 and IL8 secretion of Kupffer’s cells. The hepatocyte injuries caused by active molecules released from Kupffer’s cells decreased in the presence of WuLing Capsule. CONCLUSION: WuLing Capsule may exert some therapeutic effects by the down regulation of cytokines in chronic hepatitis. 【Keywords】 WuLing capsules； Kupffer’s cells； cytokine； lipoposccharide 【摘要】 目的：探讨五灵胶囊对枯否细胞（Kupffer cells, KC）释放细胞因子介导肝细胞（hepatocellular cells, HC）损伤的作用. 方法：分离并纯化HC与KC并建立LPS及DGlaN损伤肝细胞模型，观察五灵胶囊对2种损伤模型的作用以及对LPS诱导KC释放细胞因子介导肝细胞损伤的作用. 结果：五灵胶囊2个剂量能有效地阻滞LPS，DGlaN损伤肝细胞以及降低LPS诱导KC释放TNFα，IL6，IL8水平，抑制KC释放细胞因子损伤肝细胞. 结论：五灵胶囊遏制KC大量释放细胞因子是治疗慢性肝炎作用机制之一. 【关键词】 五灵胶囊； 枯否细胞； 细胞因子；脂多糖 0引言 慢性肝炎患者血清和肝组织中TNFα，IL6，IL8诱导肝损伤的发生和发展是与集聚在肝脏的KC密切相关，激活KC释放TNFα，IL6和IL8等炎性因子在肝脏免疫病理损害中起着重要作用［1］，以往研究表明五灵胶囊对慢性肝炎患者良好的治疗作用已被临床和实验证实［2,3］. 五灵胶囊治疗肝损伤机制鲜见报道，我们采用大鼠肝细胞与KC细胞为靶细胞，在体外观察五灵胶囊(WuLing)对脂多糖（LPS）和D氨基半乳糖（DGlaN）诱导肝细胞损伤和LPS诱导KC释放因子的作用以及CD14表达，旨在阐明五灵胶囊降酶保肝的作用机制. 1材料和方法 1.1材料 ① 动物：SD大鼠，♂，［第四军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：医动证字SC×K（军）200205］；②试剂与药品： RPMI Medium 1640培养基（批号：1080385，USA. Gibco公司）；DMEM・F12培养基（批号：1095578，USA.Gibco公司）；新生牛血清（NBS）（杭州四季青，批号：200206112，用前灭活56℃，30 min）；脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）(USA.Sigma公司)；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDHL）试剂盒（北京中生北控生物科技股份有限公司）；单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）、谷胱甘肽S转移酶（glutathione stransferase，GSHST）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNFα）、白细胞介素6（interleukin 6，IL6）、白细胞介素8（interleukin 8, IL8）试剂盒（北京北方生物技术研究所）；Raabit antiCD14，Raabit antiTNFα（武汉博士德生物工程有限公司）；五灵胶囊（西京医院制剂室生产，批号：20020207）；1252型紫外分光光度计（日本岛津）；BB16/贺利气体培养箱（德国HERAEUS公司）. 1.2方法 1.2.1供试液的制备1640维持液：取灭活小牛血清10 mL加RPMI 1640 90 mL，即得；1640生长液：取灭活小牛血清20 mL加RPMI 1640 80 mL，即得；DMEM维持液：取灭活小牛血清10 mL加DMEM・F12 90 mL，即得；DMEM生长液：取灭活小牛血清20 mL加DMEM・F12 80 mL，即得；LPS贮备液：精密称取LPS 1.0 mg，加1640 DMEM维持液溶解至10 mL，微孔滤膜除菌，-20℃冷藏，备用；20 μg/L LPS供试液：取LPS贮备液加DMEM维持液稀释至20 μg/L，临用现配；60 μg/L LPS供试液：取LPS贮备液加混合液（肝细胞培养上清和1640维持液1∶1混合）稀释至60 μg/L，临用现配；0.5 mmol/L DGlaN供试液：精密称取DGlaN 5.38 mg，加DMEM维持液10 mL，微孔滤膜除菌，-20℃冷藏，用时加DMEM维持液稀释至50 mL；五灵胶囊供试液：取五灵胶囊内容物20 g，加乙醇150 mL回流提取1 h，滤过，减压回收乙醇，残渣加DMSO溶解制成1.0 kg/L（以药粉计）的贮备液，微孔滤膜除菌过滤（0.22~0.45 μm），用时取1.0 kg/L的贮备液加DMEM维持液稀释至终浓度为（4, 3, 2 g/L）为肝细胞受试药物；另取1 g/L的贮备液加1640维持液稀释至终浓度为（0.2, 0.1 g/L）为KC细胞受试药物. 1.2.2大鼠原代肝细胞分离与药效试验取12 wk龄大鼠3只，质量180 g，♂，乌拉坦2 mL麻醉(250 mg/L, ip)，按文献［4］操作制备原代肝细胞，肝细胞重悬于DMEM生长液中，调整细胞密度为2×108个细胞/L，接种于24孔培养板内，置37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养48 h后，吸弃培养液；加4，2 g/L浓度五灵胶囊与肝细胞培养32 h,台盼蓝拒染试验和MTT活性试验检测受试药物对细胞毒性的影响,台酚蓝拒染率>95%、MTT检测肝细胞活性A490 nm 0.550～0.650，进行试验. ① 肝细胞修复试验：取培养板内细胞分为：正常组、DGlaN（或LPS）,五灵胶囊4, 3和2 g/L组，正常组每孔加DMEM维持液；DGlaN, LPS 2种损伤组与五灵胶囊3个剂量组分别加0.5 mmol/L DGlaN, 20 μg/L LPS供试液培养24 h，每组每剂量，1 mL/孔(n=8)，吸弃培养上清；正常组、DGlaN与LPS 2种损伤组加DMEM维持液，五灵胶囊3个剂量组加相应的剂量供试液1 mL/孔，继续培养24 h，收集培养上清，测定ALT, MAO, LDHL, GSHST和MDA; ② 肝细胞保护试验：另取肝细胞置24孔板内培养、分组同上，正常组和DGlaN, LPS损伤组加DMEM维持液1 mL/孔，五灵胶囊3个剂量组加相应剂量供试液1 mL/孔，培养24 h，吸弃上清液，全部试验组经无血清DMEN培养液漂洗1次，吸弃洗涤液；正常组加 DMEM维持液，DGlaN, LPS损伤组与五灵胶囊3个剂量组分别加含有0.5 mmol/L DGlaN, 20 μg/L LPS供试液1 mL/孔，继续培养24 h，取上清液测定ALT, MAO, LDHL, GSHST和MDA. 1.2.3KC细胞分离与TNFα，IL6，IL8检测按冯俊明等［5］介绍方法，沉淀细胞用200 mL/L小牛血清培养液洗涤，3000 r/min离心10 min，2次；4 g/L台盼蓝拒染，调整细胞密度1×1011个/L后，接种于培养瓶内置37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养，经反复传代纯化后细胞用于试验. 取24孔培养板2块，每孔加入8 mm×8 mm玻片1张，每孔接种纯化KC悬液1 mL（每mL含细胞数约1×108个），置37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养使细胞长成单层，分组；正常组、模型组、五灵胶囊2个剂量组（200, 100 mg/L），每组8孔，正常组、模型组加1640维持液，五灵胶囊2个剂量组分别加入200, 100 mg/L 五灵胶囊供试液1 mL，继续培养24 h，弃除上清，正常组继续加1640维持液、模型组、五灵胶囊2个剂量组加含60 μg/L LPS供试液1 mL，继续培养12 h，收集各组细胞上清至-80℃保存，按TNFα, IL6, IL8试剂盒说明书项下操作测定含量. 在含小盖玻片的24孔板，取出小盖玻片，0.01 mol/L pH 7.4的PBS缓冲液洗涤2次，固定于预冷至4℃丙酮固定液中10 min，-20℃保存. 1.2.4HE与免疫细胞化学染色取KC玻片行HE染色，光镜观察细胞形态学；链霉菌抗生物素过氧化物酶免疫组化染色：对KC玻片分别与抗CD14（1∶100）、抗TNFα的mAb进行孵育，按试剂盒操作说明进行免疫组化反应，用二氨基联苯胺（DAB）0.3 mL/L H2O2系统显色10 min. 苏木素衬染、脱水透明后，中性树胶封片. 阴性对照用PBS取代一抗. 结果评定：标本中无明确阳性反应者为阴性，以-表示阳性表达，以+表示强度. 1.2.5诱生的细胞因子对肝细胞作用取1.4项下KC调整细胞密度1×1011个/L，置24孔板（n=3）内，37℃ 50 mL/L CO2孵箱内培养，待长至单层，吸弃上清，分组：正常组和细胞因子诱生组，正常组KC加1640维持液(n=8)；余下设细胞因子诱生组：KC加60 μg/L LPS供试液1 mL培养12 h，取上清备用；另取1.3项下肝细胞（24孔板）置吊篮内，4℃ 800 r/min离心15 min，弃除上清，分4组：正常组、细胞因子组、五灵胶囊200和100 mg/L组(n=8). 正常组与细胞因子组加DMEM维持液1 mL，五灵胶囊组加含200, 100 mg/L五灵胶囊供试液1 mL培养24 h后，4℃ 800 r/min离心15 min，吸弃上清液，正常组加正常KC培养上清，细胞因子组与五灵胶囊2个剂量组加细胞因子诱生组的KC培养上清1 mL/孔，继续培养24 h后取上清测定ALT, AST和LDHL酶活性. 统计学处理： 所测数据以x±s表示，采用SPSS 10.0统计软件，Tab 1, 2, 3, 4资料用KruskalWallis秩和检验。