山 东 大 学 微 生 物 学 实 验 报 告 微生物的大小测定 胡雪芳 201300261033 【实验目的】 1. 了解显微镜测定微生物大小的原理 2. 学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微 尺、镜台测微尺的校正技术与测定细胞大小的技术 【实验原理】 微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一， 也是分类鉴定 的依据之一由于菌体很小、只能在显微镜下来测量用于测量微生 物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺 1. 目镜测微尺 目镜测微尺是一块圆形玻片， 在玻片中央把5mm长度刻成50等分， 或把 10 mm 长度刻成 100 等分（如图 1 所示） 图 1 目镜测微尺 测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间 像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象由于不同目镜、物镜组 合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样， 因 此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校 山 东 大 学 微 生 物 学 实 验 报 告 正， 以求出在一定放大倍数下， 目镜测微尺每小格所代表的相对长度 2. 镜台测微尺 镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片， 一般将 lmm 等分 为 100 格，每格长 l0μm（即 0.0lmm） ，是专门用来校正目镜测微尺 的（如图 2 所示） 。
图 2 镜台测微尺 校正时，将镜台测微尺放在载物台上， 由于镜台测微尺与细胞标本 是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野， 即 镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大， 因此从镜台测微尺 上得到的读数就是细胞的真实大小， 所以用镜台测微尺的已知长度在 一定放大倍数下校正目镜测微尺， 即可求出目镜测微尺每格所代表的 长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微 尺在同样放大倍数下测量微生物大小 【实验材料】 1. 菌株 酵母菌液， 枯草芽孢杆菌斜面培养物 山 东 大 学 微 生 物 学 实 验 报 告 2. 仪器和用具 普通光学显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、酒精灯、吸水纸、擦 镜纸、结晶紫染液等 【实验步骤】 1. 目镜测微尺的校正 （1） 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目 镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上 （2） 先用低倍镜观察， 对准焦距， 视野中看清镜台测微尺的刻度后， 转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动 器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔 细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜 测微尺的格数和镜台测微尺的格数。
（3） 因为镜台测微尺的刻度每格长 l0μm，所以由下列公式可以算 出目镜测微尺每格所代表的长度 目镜测微尺每格长度（μm） = 两重合线间镜台测微尺的格数× 10 两重合线间目镜测微尺的格数 （4） 用此法分别校正在物镜倍数为 10×，40×，100×下目镜测微 尺每小格所代表的长度 2. 酵母菌大小的测定 （1） 取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片 （2） 移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的 物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽 山 东 大 学 微 生 物 学 实 验 报 告 各占几格 （不足一格的部分估计到小数点后一位数） 测出的格 数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽 3. 枯草芽孢杆菌大小的测定 （1） 将载玻片洗净晾干后，在其中央滴一滴蒸馏水，然后通过无菌 操作用接种针取少量枯草芽孢杆菌的斜面培养物于蒸馏水中， 然后干燥 （2） 单染色：用结晶紫染液或美兰染液对其进行单染色，染色一定 时间后冲洗载玻片的背面，将染液冲洗掉如要观察芽孢，需 进行孔雀绿染色 （3） 将制好的片子置于显微镜下镜检，用目镜测微尺测量枯草芽孢 杆菌的长和宽。
【实验结果】 1. 目镜测微尺的标定结果 表 1.目镜测微尺的标定结果记录表格 物镜倍数（目镜均 为 10 倍） 目镜测微尺格数 （小格） 镜台测微尺格数 （小格） 目镜测微尺平均每 格的长度/（μm） 10 倍 100 100 10 40 倍 100 25 2.5 100 倍 100 10 1 2. 酵母菌的大小测定结果 表 2.酵母菌的大小测定结果记录表格 编号 1 2 3 4 5 范围/μm 平均值/μm 直径/μm 5.0 4.8 6.0 7.0 5.0 4.8-7.0 5.56 酵母菌大小为直径 4.8-7.0μm，平均大小为直径 5.56μm 山 东 大 学 微 生 物 学 实 验 报 告 3. 枯草芽孢杆菌的大小测定结果 表 3.枯草芽孢杆菌的大小测定结果记录表格 编号 1 2 3 4 5 范围/μm 平均值/μm 短轴/μm 0.8 0.7 0.7 0.8 0.8 0.7-0.8 0.76 长轴/μm 2.5 4.0 2.0 2.0 3.1 2.0-4.0 2.72 枯草芽孢杆菌大小为 0.7-0.8μm×2.0-4.0μm， 枯草芽孢杆菌平均 大小为 0.76μm×2.72μm。
【分析与讨论 】 注意事项： 1. 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必 须针对特定的显微镜和附件 （特定的物镜、 目镜、 镜筒长度） 进行， 而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜 或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度 2. 测量菌体大小时要在同一个标本片上测定至少 3 个大小相近的菌 体， 求出平均值， 才能代表该菌的大小 而且一般是用对数生长期 的菌体进行测定 分析讨论： 1. 在目镜测微尺矫正的时候， 不同的倍数需要分别矫正 但是也正是 由于放大的倍数不一样，是使在矫正的时候镜台测微尺的刻度线 不断放大， 也为最终的读数带来了一定的误差 因为放大的倍数越 高， 测量的越精确 所以用 100 倍物镜测得的应该是最准确的 其 中酵母菌大小的参考值为：1-5 微米×5-30 微米；枯草芽孢杆菌 的大小的参考值为：细胞 0.7-0.8 微米×2-3 微米，芽孢 0.6-0.9 山 东 大 学 微 生 物 学 实 验 报 告 微米×1.0-1.5 微米测得值均在参考值的范围内 2. 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必 须针对特定的显微镜和附件 （特定的接物镜、 接目镜、 镜筒长度等） 进行， 而且只能在这特定的情况下重复使用。
高倍镜的单格长度比 低倍的精确， 因此需要尽量使用 100 倍油镜下测量菌体 （孢子） 的 大小。