耐热DNA聚合酶常见问题(Thermpholic Polymerases FAQ)什么是 VentR、VentR (exo-)> Deep VentR 和 Deep VentR(exo-) DNA 聚合酶？NEB公司研发的VentR和Deep VentR DNA聚合酶都是克隆于海底高温喷泉的微生物，其耐 热性能和保真性能远高于Taq DNA聚合酶o VentR的半衰期在100 C时是1.8小时，是Taq DNA聚合酶的18倍，而Deep VentR则对高温的耐受性更强，半衰期是8小吋两者的保 真性能是Taq DNA聚合酶的5・15倍由于具有3^5*的外切酶活性，可去除错配的碱基， 从而使延伸反应顺利地进行下去，因此，更适用于long PCR反应在不断寻找新酶的基础上，NEB还致力于对原有酶的修饰和改造，VentR (exo-)和Deep VentR(exo-) DNA聚合酶就是在原有酶的基础上，去除其3,-5,的外切酶活性，使其更适用 于双脱氧法测序和高效率的PCR虽然保真性能比VentR和Deep VentR有所降低，但仍是 Taq DNA聚合酶的2倍如何应用DNA聚合酶合成4一 15 kb的PCR产物？使用正确的酶量。
使用具有校读功能的VentR DNA聚合酶时，有时用量少，效果会更好 使用不具有校读功能的VentR (exo-)或Deep VentR (exo-) DNA聚合酶时，每100 ul反 应体系中，用2—4个单位的酶量如果反应体系缩小，相应调整酶量采用正确的引物延伸吋问，按每延伸1 kb需要1分钟来计算当使用具有校读功能的DNA 聚合酚时，延伸反应时间不要超过计算时间的20%使用VentR或Deep VentR DNA聚合酶 时，请分别尝试2、4和6mM的MgSO4浓度为什么PCR反应后，没有产物或条带模糊？检查Mg2+浓度、聚合酶用量及延伸反应时间尝试不同退火温度及Mg2+的浓度用酚/氯 仿抽提及酒精沉淀法纯化DNAo避免高盐带入PCR反应体系中确保dNTP没有被水解某些助溶剂如：100 ng/mlBSA, 1-10%甲酰胺(formamide)或1 — 10%DMSO有助于一 些引物和模板的结合什么原因可以造成没有加入模板的阴性对照出现模糊条带？一旦某些Km值较低的DNA聚合酶(特别是具有校读功能的聚合酶)不能有效地结合到引 物的3,末端，可使引物形成一种特殊结构(primer artifact)。
这种结构含有单链和双链的区域, 形成引物单链或双链的多聚体，很难迁移出上样孔，或自上样孔形成模糊条帶如杲出现这 种情况,建议降低引物浓度,缩短反应时间,或使用VentR (exo-)s Deep VentR (exo-)和 Taq DNA聚合酶使用VentR或Deep VentR DNA聚合酶，产生什么样末端的DNA片段？具有校读功能的DNA聚合酚(如VentR> Deep VentR和9oNm)产生95%的平末端与TaqDNA聚合酶相似，不具有校读功能的DNA聚合酶，如VentR (exo-)和Deep VentR (cxo・) 产生两种末端，其中70%是平末端，30%是3,末端单个碱基突出的粘性末端我想克隆PCR产物，这个PCR产物是用VentR或Deep VentR DNA聚合酶合成的，选用哪 种克隆方法更好？最好的方法是：用平末端克隆法将片段插入已去磷酸化的载体上，(或使用NEB平端克隆试 剂盒#E0103)o插入片段的亍末端应磷酸化，除非在引物合成时，引物的亍末端已有磷酸基PCR产物是否能在PCR反应体系中直接磷酸化？不能，因为PCR反应中的硫酸胺会抑制T4多聚核苛酸激酶活性。
可采用胶回收或G25离 心柱法来纯化DNAo在50 1反应体系，加入1XT4 PolynucleotideKinase Buffer、1 mM ATP和 小于200 pmol的亍轻基末端的DNA, 70 C温育5分钟，冰 上冷却后，再加入20个单位的T4多聚核昔酸激酶，37 C温育30分钟怎样才能提高PCR产物平滑末端的连接效率？载体应该去磷酸化以降低自身环化，插入片段的亍末端应具有磷酸基其它提高连接效率的 方法还有：降低ATP在连接反应缓冲液中的浓度，增加插入片段与载体的比例或使用快速 连接试剂盒(NEB #M2200)o另外，可使用平端克隆试剂盒(NEB #E() 103)VentR或Deep VentR DNA聚合酶产生平滑末端，可是我要用的克隆试剂盒是针对3,末端单 个腺瞟吟碱基突出的粘性末端而设计的，怎么办？用Taq DNA聚合酶处理PCR产物的平末端首先用酚、氯仿抽提及2倍异丙醇沉淀，纯化 DNA,然后将纯化后的DNA溶于1 X Thermopol Reaction BufferC随Taq DNA聚合酶提供), 再加入1个单位的Taq DNA聚合酶和200 M M dATP,混匀，72 C温育20分钟。
能否用VentR或Deep VentR DNA聚合酶來处理Taq DNA聚合酶产物，得到平滑末端的PCR 产物？能首先将Taq DNA聚合酶的PCR产物用酚、氯仿抽提及2倍异丙醇沉淀，得到进一步纯 化的 DNA,然后将纯化后的 DNA 溶于 1 X Thermopol Reaction Buffer (随 VentR 或 Deep VentR DNA聚合酶提供)，在100 P 1反应体系中，加入1 一2个单位的VentR或Deep VentR DNA聚合酶和20()uMdNTP,混匀，72 C温育20分钟，产品即可产生平滑末端。