IVIUI十 TU IVIULO毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶一一 A0X1及A0X2细胞中大多数的醇氧化 酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型 的是 占可溶性蛋白的30%以上AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入 诱导 物甲醇转录仍受抑制为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培 养注 意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱 导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的AOX1基因已被分离，含AOX1启动 子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带 AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株在YPD酵母 膏、蛋白豚、葡萄糖）培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间 大约为2h ° Mut+和 Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样 的，存在甲醇 的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一 倍的时间大约为18个小时。
菌株GS115 > X- 33、KM71 和 SMD1168 的区另 I]GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母 相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠 结构GS115 > KM 71 ' SMD1168在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸 的 培养基上筛选转化子这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般 低于10- — j、 I z 5 » I —I n_1 —tzm ||—r y I lj /1_I 7 Lx、1 ] I r y I lj 1 i jlj/vl_Mut+,也可能是Muts （载体取代AX01基因）,可以在MM和MD培养基上 鉴定表 型SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突 变，是蛋 白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115 一样都是属于MUT+表现型，也就是说可以在含甲醇的 培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸U!U!U!裂解酶基因（arg4）有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。
用野生型ARG4基 因（约2kb）插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI （A0X1基因密码 子）及Sall（AOX1基因密码子）位点，取代了 AOX1基因16-227密码子 此结 构转化至KM71 亲本菌（arg4his4）中，分离产生KM71 MutsArg+His菌株，Arg+转化子遗传分析显示 野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，所以KM71所有转化子都是Muts表型AOX1位点没有被完 全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换aox1::ARG4结构，这样重组菌株的表型是His+MutsArg-,这意味着重组菌株生长时需精氨酸但仅添加精氨酸并不能完全缓和arg4突变的影响arg4菌株在含!1!精氨酸的最小培养基中不能很好地生长因此不推荐在KM71中通过取代aox1::ARG4结构来获得His +转化子一般来说，如果是胞内表达，应尽量用Muts细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧 化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多，使下游纯化更易进行而对于分泌蛋白的表 达，无论是甲醇利用慢（Muts）还是甲醇利用快（Mut+）的细胞都可应用基因重组Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达，包括启动子、外 源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。
细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程的难点，因为木线性化的外状质粒之间发生同源重组的几率非常低，所以重 组转移 载体必须用特定的限制性内切酶进行线性化处理这 种处理的目的是防止随机插入重 组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失 活，让同源重组以指定的方式发生表达载体主要分为以下几类：(1) 胞内表达载体主要有PHIL-D2、pA0815、pPIC3K pPICZ pHWOlO, pGAPZ pGAPZa(lnvitrogen 等该类载体可 以将目的基因表达在胞内，可以避免毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖 基 化相尖基因的表达；(2) 分泌型表达载体主要有pPIC9、pHIL-S 1、pPICZ a pYAM75P等由于毕赤酵母本身的泌内源蛋白非常少，将外源蛋 白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积累常用的分泌的信号序 列主要是由89个氨基酸组成的a!1!交配因子(a-factor)的引导;(3) 多拷贝插入表达载体如PPIC9K, pPIC3.5K在某些情况下，毕赤酵母中重组基因多拷贝整合可增加所需蛋白的表达量该载 体均可用于在体内(PPIC3.5K大多数转化子是Mut+表型；然而由于质粒含有AOX1基因序列，有可能 在AOX1位点发生重组，破坏野生型AOX1基因，产生His+Muts转化子，则需要在 MD及MM平板上检测可证实His+ Mut+转化子。
线性化酶切位点插入事件GS115表型KM71表型Sall 或 Stul 插入 his4Sacl 插入 5’A0X1 His+Mut+His+MutsBglll 取代 AOX1His+MutsHis+Muts 不推荐)xx酵母表达常用培养基10x YNB(13.4%的无氨基酸酵母氮源),134gYNB固体溶于1L蒸馆水，过滤灭菌,4C保 存YPD完全培养基：酵母提取物10g/L,蛋白陈20 g/L,葡萄糖20 g/L(固体培养基含1.5%xx)转化培养基RDB :每10OmL加入Lh梨醇18g(186 g/L),琼脂糖2g(20g/L)12lC灭菌20分钟，然 后 待温度降至60C以后在超净台上加入10x YNB 10mL(13.4 g/L), 10 ＞葡萄糖 10mL(20 g/L), 500 X 生物素0.2mL(4 x 10-4g/L)100 x AA1mL混匀，倒平板(灭菌时只加入80ml水即 可)选择培养基MD (最小葡萄糖):配100mL,向80mL水中加入琼脂糖2g(20g/L)12lC灭菌20分钟，待温度 降至 60C以后在超净台上加入10X YNB 10mL(13.4 g/L), 10 ＞葡萄糖 10mL(20 g/L), 500 X 生物素选择培养基MM(最小甲醇)：配100mL,向90mL水中加入琼脂糖2g(20 g/L) 12TC灭菌20分钟，待温度 降至 60C以后在超净台上加入10X YNB 10mL(13.4 g/L) , 500〉生物素0.2mL(4 x 10-4g/L)0.5mL 甲醇(0.5%)。
诱导表达培养基BMGY :配亿，酵母提取物10g/L,蛋白B 20 g/L, 3g/L K2HPO4,11.8g/L KH2PO4,加水至890mL, 121 C灭菌20分钟，然后待温度降至60C以后在超净台上 加入 10xYNB100mL(13.4g/L), 500 Xfe 物素 1 mL(4 x 10-4g//)甘油 10mL诱导表达培养基BMMY :酵母提取物10g/L ,蛋白豚20g/L, 3g/LK2HPO4,■2PO4,加水至895mL, 121C灭菌20分钟，然后待温度降至60C以后在超净台上 加入 100X YNB100mL(13.4g/L), 500 座物素 1mL(4 x 10・ 4g/,甲醇 5mLBMG Y/BMMY含酵母浸出物及蛋白月东，可稳定分泌蛋白，阻止或减少分泌蛋白的分解如果目的蛋白对中性PH蛋白酶敏感的话，可在无缓冲培养基(MGY、MM) 中表达如果没有证据证明你的分泌蛋白对中性 RH值蛋白酶敏感，建议开始表达时用BMMY o如果表达蛋白降解了，尝试在无缓冲培养基中进行表 达°如果以上条件仍不能有效防止蛋白降解可将基因转入SMD1168中，该菌株 表型 是his4pep4缺失了蛋白酶，转化与表达程序与GS115相同，也可用于大规模发酵。
用考xxxxG-250测蛋白含量。