Chapter 3 Transcription（Ⅱ ）RNA的加工、修饰与编辑1一、原核生物的RNA转录后加工与 修饰2（一）原核生物的mRNA转录后加工原核生物的结构基因是连续编码序列 ，转录形成的mRNA绝大数不需加工修饰 原核生物没有核膜，转录和翻译是相偶 合的，往往转录还未完成已开始翻译3（二）原核生物rRNA前体的加工 • ①rRNA在修饰酶催化下进行碱基的甲基化 修饰； • ②rRNA前体被RNaseⅢ、RNase E、 RNase P、RNase F等剪切成一定链长的 rRNA分子； • ③rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小 亚基45（三）原核生物 tRNA的加工 • ①tRNA前体被tRNA剪切酶切成一定大小 的tRNA分子 • 大肠杆菌RNase P（tRNA 5’成熟酶）可特 异剪切tRNA前体的5’端顺序 • RNase D是tRNA 3’端成熟酶，它可将 tRNA前体3’端的一段核苷酸序列切除6• ②成熟tRNA分子中的稀有碱基是通过修饰 形成的 • 如：嘌呤生成甲基嘌呤；尿嘧啶还原为双 氢尿嘧啶；尿嘧啶核苷转变为假尿嘧啶核 苷；腺苷酸脱氨基成为次黄嘌呤核苷酸等 。
7• ③3’-末端加上CCA • 在核苷酸转移酶作用下，3’-末端除去个别 碱基后，换上tRNA分子统一的CCA-OH末 端，完成tRNA分子中的氨基酸臂结构89• 原核生物中有2种3’-端不同的tRNA前体： Ⅰ型3’-端有CCA序列；Ⅱ型没有CCA， tRNA核苷酸转移酶可将CCA加到3’端• 真核生物中可能所有的tRNA前体都属于Ⅱ 型，在成熟时都需要通过酶的作用，在其 3’端加上CCA序列10二、真核生物RNA的合成与加工1112• 在真核生物中已发现了RNA polⅠ、Ⅱ、 Ⅲ、线粒体RNA pol和叶绿体RNA pol等， 它们专一性地转录不同的基因 • 线粒体和叶绿体的RNA pol类似于细菌的 RNA pol • 鹅膏蕈碱是真核生物RNA聚合酶特异抑制 剂，3种真核RNA pol对鹅膏蕈碱的敏感性 不同13141516• （1）RNA聚合酶Ⅰ位于核仁中，负责转录 编码rRNA的基因（细胞内绝大部分RNA是 rRNA） • （2）RNA聚合酶Ⅱ位于核质中，主要负责 核内不匀一RNA的合成，而hnRNA是 mRNA的前体 • （3）RNA聚合酶Ⅲ负责合成tRNA和许多 小的核内RNAs。
17• 原核生物靠RNA聚合酶就可完成从起始、 延长、终止的转录全过程； • 真核生物转录除RNA聚合酶外还需另一些 叫做转录因子的蛋白质分子参与转录的全 过程18• RNA聚合酶II及转录因子是在启动子上装配 的 • 真核生物的RNA聚合酶借助于转录因子来 辨认启动子及解开双螺旋 • 与RNA PolⅡ联合的转录因子有TFⅡA、 TFⅡB、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF和TFⅡH 等6种19• TFⅡD能与启动子结合，并吸引其它转录 因子以及聚合酶进到转录启动区 • 转录因子与RNA polⅡ共同组成转录起始 复合物，转录才能在正确的位置上开始2021• TFⅡH利用ATP的能量解开双螺旋DNA 熔链的位置约从转录起点上游10bp开始， RNA PolⅡ根据模板链的碱基顺序将NTP 聚合成RNA • 在RNA延伸的阶段，除了TFⅡF仍与聚合 酶结合外，其余的转录因子都离开RNA PolⅡ22• RNA PolⅡ最大的亚基C端的一段肽链称为 CTD(carboxyl-terminal domain)含有很 多个脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸启动转录 时CTD需处在未磷酸化状态启动后CTD 需被磷酸化才能延伸RNA。
2324真核基因转录起始是基因表达调控的 关键，多种蛋白因子间相互作用，以及这 些蛋白因子与DNA元件相结合，构成控制 基因转录开始的复杂体系 25真核生物转录的延伸阶段与原核生物 相似合成速度30~50nt/S，但速度不定， 遇到G/C后，时间延迟262.真核RNA合成的终止对真核生物转录的终止和机制了解很 少由于RNA转录后很快就进行加工，很 难确定原初转录物的3’-末端 27RNA PolⅡ所转录的基因在最后一个 外显子下游都具有一个加Poly-A的信号 AATAAA序列，而RNA PolⅡ一般在该位 点下游停止转录 28293.RNA转录后的加工与修饰真核细胞所有RNA都是以复杂的初级 转录物形式被合成的似乎RNA的加工成 熟对调节mRNA、rRNA和tRNA从胞核到 胞浆转运起关键作用3031• 割裂基因（split gene）：指编码某一 RNA的基因中有些序列并不出现在成熟的 RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被 其他的序列隔开 • 内含子（intron）：原初转录物中通过 RNA拼接反应而被去除的RNA序列或基因 中与这些RNA序列相应的DNA序列 • 外显子（exon）：割裂基因中在成熟 mRNA 产物中表现的任何片段或对应于 DNA上的该序列 。
323.1 mRNA的加工修饰真核生物转录和翻译在时间和空间上 是分开的，刚转录出来的mRNA分子是复 杂的前体，且大小很不一致，即核内不均 一RNA (heterogeneous nuclear, hnRNA) 33RNA pol的CTD在延伸过程中被磷酸 化，可募集5’加帽酶、剪接机器的组分以 及多聚腺苷酸化所需要的酶其实在RNA 被合成达到20～40nt时就开始进入加工阶 段3435hnRNA分子经裂解和拼接，只有少部 分序列转变为成熟的mRNA，其余在加工 过程中被降解3637• hnRNA半寿期一般为几min~1hr，比细胞 质中的mRNA更不稳定，细胞质mRNA的 半寿期为1~10hr，神经细胞mRNA的半寿 期最长可达数年 • 真核生物转录生成的mRNA为单顺反子3839真核生物mRNA的加工修饰包括： • 5’端形成帽子结构； • 3’端加polyA； • 剪接除去内含子和甲基化40① 5’-端加帽成熟的真核生物mRNA的5’-端有 m7GPPPN结构，称为甲基鸟苷帽子它是在RNA三磷酸酶，mRNA鸟苷酰 转移酶，mRNA（鸟嘌呤-7）甲基转移酶 和mRNA（核苷-2’）甲基转移酶催化形成 的。
415’帽子的功能（1）有助于mRNA越过核膜，进入细胞质； （2）mRNA 5’-端帽子结构是翻译起始所必 要的，为核糖体识别mRNA提供了信号， 并协助核糖体与mRNA结合使翻译从AUG 开始 （3）帽子结构可增加mRNA的稳定性，保护 mRNA免遭5’→3’核酸外切酶的攻击42② 在3’-端加尾巴大多数真核mRNA在3’-端都有约 150~200nt的Poly（A）尾巴Poly（A） 尾是转录后在核内加上的43• 真核基因的3’端有AAUAAA序列，作为 mRNA 3’-端加polyA尾的信号 • hnRNA链在加尾巴信号下游11~30nt处切 断磷酸二酯键，polyA聚合酶 催化在3’-OH 上逐一引入100~250个A4445Poly（A）尾巴的功能 （1）防止核酸外切酶对mRNA信息序列 的降解，起缓冲作用2）可能与mRNA从细胞核转送到细胞 质有关3）Poly（A）尾巴可能对真核mRNA的 翻译效率具有某种作用，使mRNA较容易 被核糖体辨认46poly(A) 在分子生物学实验中有很大 应用价值a、 也可将 oligo (dT) 与载体相连，从总体 RNA中分离纯化mRNA b、 用寡聚dT（oligo (dT)）为引物，反转 录合成 cDNA4748③ mRNA甲基化真核mRNA往往有甲基化位点，主要是 在N6-甲基腺嘌呤（m6A）。
这种甲基化修 饰对翻译没有必要，可能在mRNA前体加 工中起识别作用493.2 mRNA前体（hnRNA）的拼接真核生物的结构基因中具有可表达活性 的外显子，也含有无表达活性的内含子（ 断裂基因）5051• 内含子的数量与所在基因的大小有关许 多基因中的内含子参与基因表达调控外 显子一般大小为100～200BP，内含子＞ 1kb52在转录时，外显子及内含子均转录到 hnRNA中核中hnRNA在核酸内切酶作用 下剪切掉内含子，然后在连接酶作用下， 将外显子各部分连接起来，而变为成熟的 mRNA5354• mRNA前体剪接位点是由内含子末端的序 列规定的 • 通过对100多种真核细胞基因的分析，发现 所有内含子都是以GU开始，以AG告终的 保守序列 • 同时内含子还有一个重要的内部位点—— 分支点5556• RNA的剪接过程中内含子的切除可能有一 定的顺序 • 通过RNA blotting可以证明卵粘蛋白的 hnRNA先切除5和/或6，然后切除4和7， 最后切内含子3 • 原则上5’剪接点可与任一3’剪接点发生剪接 ，但实际上剪接只发生在同一个内含子的 5’和3’剪接点间，其机制尚不明5758• mRNA前体的内含子末端的序列剪接位点 突变引起剪切错误。
剪切位点突变导致地 中海贫血症（thalassemia)，地中海贫血症 起因于血红蛋白合成缺陷此类贫血症中 有一类是异常剪接引起 • β-珠蛋白的第一内含子发生突变，突变位 点发生在正常3’剪接位点上游20nt处59• 60mRNA前体拼机制 • 真核细胞内存在许多种大小在100~300nt 的小分子RNA，由聚合酶Ⅱ或Ⅲ转录它 们与蛋白质形成复合物参与RNA的拼接反 应 • 如核内小RNA（snRNA）主要存在于核内 ，细胞质小RNA（scRNA）主要存在于细 胞质61• 重要的snRNA有U系列（尿嘧啶含量高而 得名）； • U系列snRNA与蛋白质结合形成核糖核蛋 白颗粒（RNP）U-snRNA参与hnRNA的 拼接过程U3-snRNA与rRNA前体的加工 有关，U1、U2、U4、U5、U6可能都与 hnRNA的加工有关 • snRNP和其他辅助蛋白共同组成一个剪接 体，它能对内含子3’和5’剪接位点和分支点 进行识别，进行剪接作用626364mRNA前体在SnRNP等的参与下，内 含子中分支点部位的腺苷酸(A)残基的2’- OH自动攻击内含子5’端与外显子1连接的 磷酸二酯键，切下外显子1。
65腺苷酸原来已有3’,5’-磷酸二酯键依然 存在，加上此2’,5’-磷酸二酯键连接后，在 腺苷酸处出现了一个套索666768已被切下的外显子1的3’-OH攻击内含 子3’-端与外显子2间的3’,5’-磷酸二酯键使 其断裂，内含子以套索的形式被切下外 显子1和2相互连接693.3 rRNA转录后加工 真核生物rRNA基因有几十至几千个拷 贝数，这些拷贝串联重复其中18S rRNA 、28S rRNA和5.8S rRNA基因成簇排列组 成一个转录单位，彼此被间隔区分开，由 RNA polⅠ转录成一个rRNA前体 70哺乳动物的初级转录产物为45S，低 等真核生物的rRNA前体为38S（果蝇38S rRNA前体、酵母35S rRNA前体）715S rRNA基因也成簇排列，存在于另一 个转录单位，由RNA polⅢ转录（为内部 启动子）它是由核仁以外的染色体基因 转录的，然后运输到核仁内参与核糖体的 装配 725S rRNA基因是由RNA聚合酶Ⅲ转录 的，原初转录物的5’端与成熟的5S rRNA 的5’端完全相同在某些生物中，3’端通常 含有多余的核苷酸，在加工时要被切除 所以,5S rRNA只需要进行简单的加工,或者 根本不需要进行加工。
73• 真核生物rRNA前体必需经过切割和修整反 应才能形成成熟的rRNA其加工过程比较 缓慢7475• 在转录过程中或刚转录完成时，rRNA中约 有1~2%的核糖单位的2’-OH被S-腺苷甲硫 氨酸经酶促而甲基化在被加工成熟的 rRNAs中，这些甲基全部被保存 • 甲基的存在是初级转录物转变成熟的rRNA 的标志7677• rRNA加。