word背景尿酸氧化酶(Urate Oxidase, EC1.7.3.3)，又称尿酸酶（Uricase）是生物体嘌呤降解代谢途径中的一种酶，大部分生物在嘌呤的代谢过程中产生尿酸，而尿酸酶能催化尿酸氧化为尿囊素许多物种中均发现有尿酸酶存在，但在鸟类，爬行类动物以及高等哺乳动物(灵长类包括人类)等生物的进化过程中，尿酸酶基因发生突变，使得在这些生物体，嘌呤不能被氧化为尿囊素，而是以尿酸为终产物尿酸及其盐类在水中溶解度很低,血液中过多积累会导致痛风综合症痛风（gout）是一组嘌呤代谢紊乱所致的疾病，其临床特点为高尿酸血症（hyperuricemia）及由此而引起的痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成 The pathway of purine metabolism目前临床上治疗痛风的主要药物是别嘌呤醇，它占领了美国95％以上的治疗痛风药物的市场它是尿酸代谢过程中黄嘌呤氧化酶的抑制剂，与嘌呤代谢物竞争性抑制黄嘌呤氧化酶，使次黄嘌呤及黄嘌呤不能转化为尿酸，从而减少尿酸的生成但该药的副作用也很明显，个别病人可有发热、过敏性皮疹、腹痛、腹泻、白细胞及血小板减少，甚而肝功能损害等副作用。
尿酸酶可以氧化尿酸为可溶性的尿囊素，在基因工程技术发展以前，从微生物中提取尿酸酶可用于临床诊断和治疗，例如产朊假丝酵母但微生物产酶量较低,限制了其广泛应用通过DNA重组技术高效表达酶基因是一条提高产酶量的途径迄今为止,已有多个物种的尿酸酶基因被克隆但是，尿酸酶仍具有蛋白质类药物的共同缺点，如在胃肠道极易被蛋白酶水解；血浆半衰期较短，需反复多次注射；并且由于大分子化合物具有免疫原性，易产生过敏反应，同时还会因局部产生抗体而减效等，这些缺点限制了尿酸酶的大围的、持续的应用实验容尿酸氧化酶的纯化尿酸氧化酶的性质研究发酵菌液（1）尿酸酶的动力学参数的测定↓ （2）尿酸酶的酸碱稳定性测定超声破碎（3）温度对尿酸酶稳定性的影响↓ 盐析↓ DEAE离子交换↓SDS-PAGE实验一尿酸氧化酶粗酶提取一． 实验目的学习可溶性表达蛋白质的初步分离纯化二． 实验原理 细菌工程菌胞表达主要分为两种形式，一种是在强启动子条件下的高效表达，由于蛋白的过度表达，使蛋白不能及时有效折叠而发生无规则卷曲，以固体颗粒的形式堆积于胞间质中，这就是所说的包涵体。
另外一种是间质的可溶性表达，即可以发生正常折叠，具有生物活性一般情况下，细菌只要被正常破壁就可以通过离心的形式将包涵体和可溶性表达的蛋白分离开用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀三．实验用品1器材：超声破碎仪，离心机 2 试剂：超声缓冲液：0.1 mol/L，pH 8.5 Tris-Gly（6.057g Tris，8.0449gGly，定容至500ml，定容前调pH至8.5四．实验方法发酵菌液4000 rpm×25 min离心，收集湿菌体，每1 g菌体加入15 ml超声缓冲液超声机粉碎破壁，功率300 w，工作时间5 s，间隔时间5 s，共90个循环取悬于超声缓冲液的菌体， 10000 g×10 min离心，上清加(NH4)2SO4至40%浓度，静置1 h，12000 g×15 min离心，沉淀用3 ml0.1 mol/L的pH 8.4 Tris-Gly悬溶；上清加(NH4)2SO4至70%浓度，静置1h，12000 g×15 min离心，沉淀保留。
五． 实验结果1.量得发酵菌液体积2.量得发酵所得湿菌体重量3.超声破碎离心后测上清OD280，体积及留样1ml实验二尿酸氧化酶柱纯化一． 实验目的学习根据蛋白质所带电荷，选择离子交换树脂进行蛋白质的分离纯化二． 实验原理离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂离子交换层析可以用于蛋白质的分离纯化由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来Sepharose是表示以琼脂糖为基质的胶，Sepharose Fast Flow分的ＤＥＡＥ，ＣＭ，Ｑ，ＳＰ就是在Sepharose分别偶联上 二乙基氨乙基，羧甲基，三甲胺基，磺丙基，作为弱阴，弱阳，强阴，强阳四种离子交换填料三．实验用品1.器材：填料：DEAE-Sepharose F.F.；核酸蛋白仪；紫外分光光度计；梯度混合仪；分步收集器2.试剂：透析液：20 mmol/L，pH8.5的硼酸盐缓冲液，即2.5747 g硼砂与2.0407 g硼酸溶于3000 ml蒸馏水。
平衡液：20 mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.5离子交换洗脱液：0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L硼酸盐缓冲液；2 mol/L NaCl，20 mmol/L硼酸盐缓冲液（pH均为8.5）三． 实验方法将硫酸铵纯化后沉淀用20ml，pH8.5，20 mmol/L硼酸盐缓冲溶解，并透析过夜透析后测量体积，测OD280及留样1ml配制20 mmol/L硼酸盐缓冲液500 ml，分别调节其pH为8.5采用上述溶液平衡层析柱，上样后以0～0.5 mol/LNaCl，20 mmol/L 硼酸盐溶液进行梯度洗脱，再以2 mol/L NaCl进行柱再生，流速2 ml/min，收集尿酸酶活力峰四． 实验结果1.记录透析后体积， OD2802.测收集的尿酸酶活力峰的紫外吸收值，并绘制尿酸酶的洗脱曲线实验三尿酸氧化酶的鉴定一． 实验目的学习通过SDS-PAGE鉴定蛋白质分子量及纯度二． 实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带三．实验用品聚丙烯酰胺储液：29 g丙稀酰胺，1 g甲叉双丙烯酰胺溶于80 ml蒸馏水，定容至100 mlTris缓冲溶液(1 mmol/L，pH6.8，积层胶)：于800 ml水中溶解121.1 gTris碱，用浓HCl调pH至6.8，最后加水定容至1 LTris缓冲溶液(1.5 mmol/L，pH8.8，分离胶)：于800ml水中溶解181.7 gTris碱，用浓HCl调pH至8.8，最后加水定容至1 L。
5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：在900 ml蒸馏水中溶解15.1 gTris和94 g甘氨酸，然后加入50 ml 10％（m/v）电泳级SDS的贮存液，用去离子水补至1000 ml6×上样缓冲液：7 ml 4×Tris-HCl (pH6.8，0.28 mol/L)，3.0 ml甘油，1 gSDS，0.93 gDTT（或两倍摩尔浓度的巯基乙醇），1.2 mg溴酚蓝考马斯亮蓝染色液：90 ml的甲醇:水（1:1，V/V）和10 ml冰乙酸混合液中溶解0.25 g考马斯亮蓝R250，过滤脱色液：45 ml甲醇、45 ml水和10 ml冰乙酸四 .实验方法取待测样液适量，加入6×上样缓冲液，混匀，沸水浴加热5 min，用于上样分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，电压80 V，电泳完毕后，剥胶，考马斯亮蓝R250染色，脱色至本底透明后摄片五． 实验结果根据电泳结果判断尿酸酶亚基分子质量及纯度实验四尿酸氧化酶的活力测定一． 实验目的通过尿酸氧化酶活力测定方法的学习，了解一类酶的活力测定方法二． 实验原理酶的活力表现为催化某一反应的速度，反应速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反应速度可以用单位时间底物的消耗量或产物的积累量来表示。
由于酶的催化作用和周围环境的关系十分密切，环境的温度、pH、离子强度等都对酶的活力有很大的影响，因此测定酶活力时应该使这些条件保持恒定 酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分钟所分解的底物量（或生成的产物量）μmol数表示之测定酶活性的方法很多，常因反应的底物和产物的性质不同可选用不同的方法，应用最广泛的是比色法或分光光度法凡反应系统中的化合物在紫外区或可见光区有吸收峰的都可以用这种方法进行测定如果酶催化的是一需氧反应，如氧化酶，则可用测压法或氧电极法如果催化的反应系统中需要ATP或产生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脱氢酶和氧化还原酶；或者反应产生H2O2，如一些氧化酶，这些酶的活性可以用生物发光或化学发光方法进行测定总之，测定酶活性的方法很多，应根据具体情况选择合适的方法三． 实验用品底物液：0.001%尿酸（缓冲体系为0.1 mol/L，pH8.5硼酸缓冲液）四． 实验方法酶活测定反应体系均为0.1 mol/L，pH 8.5硼酸缓冲液，以0.001%尿酸为底物，25 ℃反应5 min，每隔30 s测一次293 nm处吸光值酶活单位定义为每分钟催化1 μmol底物转化为产物所需的酶量。
五． 实验结果绘制尿酸酶各步骤纯化后的活力回收表实验五尿酸氧化酶性质研究一． 实验目的对尿酸酶的主要性质进行研究，探讨影响尿酸酶活力的各种因素及尿酸酶的最佳保存条件二． 实验原理酶促反应动力学（kinetics of enzyme-catalyzed reactions）：酶反应动力学主要研究酶催化的反应速度以及影响反应速度的各种因素在探讨各种因素对酶促反应速度的影响时，通常测定其初始速度来代表酶促反应速度，即底物转化量<5%时的反应速度1．底物浓度对反应速度的影响： ⑴底物对酶促反应的饱和现象：由实验观察到，在酶浓度不变时，不同的底物浓度与反应速度的关系为一矩形双曲线，即当底物浓度较低时，反应速度。