实验五 DNA 的限制性内切酶酶切反应DNA restriction enzyme digestion一、实验目的通过本实验掌握DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验过程二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之 内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA它可分为三类：I类和III类酶在同一 蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在I类酶结合 于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而III类酶在识别位点上切割 DNA分子,然后从底物上解离II类由两种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限 制酶），它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识 别序列绝大多数II类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷 酸序列（如EcoR I识别六个核苷酸序列:5'- G/AATTC-3'）,有少数酶识别更长的 序列或简并序列II类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末 端的DNA片段（如Sma:5'-CCC!GGG-3'）;有的切割位点在对称轴一侧，产生带有 单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoR I切割识别序列后产生两个互补 的粘性末端。
5'-G!AATTC-3' -5'-G AATTC-3' ； 3'-CTTAAtG •••5' —3'-CTTAA G-5'Pvu I 的识别序列 5'-CGAT|CG-3' —5'-CG AT CG—3'三、实验仪器与设备水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机， 恒温水浴锅， 微量移液枪， 微 波炉，紫外透射仪，凝胶成像系统四、实验材料与试剂pUC18质粒：2686bp, 0.5》g/p l, 40》1/管（日本东洋纺织株式会社）Pvu I酶及其酶切缓冲液：10U/p l, 200U/管（北京鼎国昌盛生物技术有 限公司）,在 pUC18 质粒上有两个酶切位点,分别为酶切第一个碱基位是 276 （896bp）、2066（1790bp）10X的酶切反应体系（使用时酶切反应体系为IX）琼脂糖（Agarose） 溴化乙锭：5XTBE电泳缓冲液：（使用时稀释10倍）6X电泳载样缓冲液：五、实验步骤1. 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管（最好0.2ml）编号，用微量移液枪分 别加入pUC18质粒2|j l （1p g）和相应的限制性内切酶反应10X缓冲液2|j l, 再加入重蒸水15》l （使总体积为19》1）,用手指轻弹管壁使溶液混匀，然后加 入1》l酶液，用吸头轻轻抽吸数次混匀酶切反应物，用微量离心机2000rpm数 秒,使溶液集中在管底。
2. 混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑 料板上），37°C水浴保温2--2.5小时，使酶切反应完全3. 每管加入2》l 0.1mol/L EDTA（pH8.0）,混匀，以停止反应,置于冰箱中保 存备用可以不加）4. 制备琼脂糖凝胶分析内切酶酶切反应结果配制1.0%琼脂糖凝胶，加入适当的EB溶液，制胶取10》l酶解液与2》l 6X载样液混匀电泳100V20min, 60V, 40min电泳结束后，紫外灯下观察结果 根据紫外灯下观察的结果，画出电泳示意图，六、注意事项1、 DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性 内切酶的活性大部分 限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响酶切时 所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应2、 当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使 用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头3如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓 度若两者可用同一缓冲液，则可同时水解若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随 后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
也可在第一个酶切反 应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积 无水乙醇，混匀后置-70°C低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲 液后进行第二个酶切反应4. 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般 DNA 用量 约为0.5T》go限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的 酶切缓冲液和最适反应温度（大多数为37C）对质粒DNA酶切反应而言，限制 性内切酶用量可按标准体系1p g DNA加1单位酶，消化1-2小时但要完全酶 解则必须增加酶的用量， 一般增加 2-3 倍， 甚至更多， 反应时间也要适当延长DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定 的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示构建DNA限制性 内切酶图谱有许多方法通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶 单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切 位点及其相对位置酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度5、许多实验制备的DNA不易于降解，需适当增加酶的使用量反应液中加入 过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
6、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲 液（1X ）进行稀释另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液 中甘油浓度控制在1/10之下，否则酶活性将受影响图例如下：M1 1 2 M21 % Agarose凝胶电泳M1； DL2.000 DNA Marker2 :质粒DNA （EcoR I Hind HI）M2：虻Hind III digest课后记：本次实验除第一批结果不好外，2，3批都非常理想，分析原因可能是酶 切时间不够以后需注意： 1 、酶切时间一定要足够（＞2小时） ，否则会切割不 好；2、电泳时需要增加一个未酶切质粒点样；便于比较观察； 3、制备凝胶是EB的浓度适当大些（40-50ul/100ml胶），使结果更为清晰，便于观察4、加样最好统一进行，先配成量大的混合组分，再分成各管，最后分别加酶3000rpm离心数秒 2012.12.08 记pUC18/ pUC19 简介SamH [rxma\pUC18、pUC19 的区别:pUC18质粒载体与pUC19质粒载体除了多克隆位点(Multiple Clone Site )部分反向互补外，其它部分完全一样。
PUC19质粒载体图谱pUC18质粒载体图谱特征:Vector size (bp)Multiple cloning siteLacZ apeptideAmpicillin resistance gene2686399-455146-4691626~2486 pUC origin黄色区域为多克隆位点 下划线部分为 lac 启动子 蓝色字体删除线M13引物 红色字体a链 蓝色字体 amp 抗性基因 蓝色背景为PVU I酶切位点TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGT CACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTG AGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGAGCGTAAGGAGAAAATACCGCA TCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGG CCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATAAGTTG GGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGC TTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATCGTAATC ATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT ACAATTCCACACAACATA CGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACAT TAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCAT TAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTT CCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCA CTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATG TGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGT T TTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGT GGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGT GCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGG GAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTT CGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTAT CCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGC AGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTG AAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCT GAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCAC CGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGA TCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACT CACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTA AATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGT TACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATA GTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCC CAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAA ACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGC。