1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性最好位于编码区5'端的 300-400bp 区域 内，可以用 DNAman,Alignment 软件 看看结果2. 产物不能形成二级结构(自由能小于 58.61KJ/mol)3.引物长度一般在17-25 碱基之间,上下游引物不能相差太大4.G+C 含量在 40%~60%之间，45-55％最佳5. 碱基要随机分布，尽量均匀6. 引物自身不能有连续4 个碱基的互补7. 引物之间不能有连续4 个碱基的互补8. 引物5'端可以修饰9.3Z端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构(2-3个)10. 引物3'端要避开密码子的第3位11 .引物整体设计自由能分布5‘端大于3'端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol可用 oligo 6 软件进行比对看结果的情况12. 做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.13. 引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区14. 引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源15. 查看有无假基因的存在假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长 度相似。
16. TM 值在 58-62 度之间17. 引物设计的软件Primer 5.0有专门针对荧光的设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡设计引用有一些需要注意的基本原理：① 引物长度一般引物长度为18~30碱基总的说来，决定引物退火温度(Tm值)最重要的因素就是引物的长度有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5°C在引物长度大于 20bp 时：62.3C+0.41°C(%G-C)-500/length-5°C另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54C的最短的引物可获得最好的效率和特异性总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形 成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小② GC 含量一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，—对引物的GC含量和Tm值应该协调。
若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5'端加适量的A、T或G、C尾巴③ 退火温度退火温度需要比解链温度低5°C,如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特 异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合一对引物的退火温度相差4C〜 6C不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55C〜75C间变化④ 避免扩增模板的二级结构区域选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板实验表明，待扩区域自由能（△））小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功若不 能避开这一区域时，用7-deaza-2' -脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的⑤ 与靶DNA的错配当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条 带出现这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/选 择 Align two sequences （bl2seq），如下图。
JStt二甲坐迂釁賈」怦穴电購俸’毀議饼 罐址“山］边 hl 1 ;.:；•：：："wit. n^bi- nli. nlk iov/HLlgTfTtiq StatislK s of Sequance SmilMtty W 匚 ores• AfMnn bf dqiETi ・Ort 齐 tin* |1.盯矶 I「or»・ r肌 cn--o ™* . Off*.m. sea ist»p1 cirSoftwEre• A^Ebti -qpjrv 祚 Lr ir^idrtiori tzUM^iw (rbtaCn)* - is e-i. j _.j-w".•肚皿* hHrtispeeui|：KW3：I* krrwMM SL£・■ MEiUWT■ Dcwnl^nds• Developar info■ Mailinglist■ ContactUK■ Rrf Llir&d 九酉V 柘 1rrdj：tc dK^j-yflfEHeJCTi]當旳T卡丰0尿』阪laBio已oju■ RelarBncasBLAST 的使用方法也十分简单，如下图所示□：；.--.-J(?r!■；-<■;百rrt田匸 sion or GI山理|1上呂怙氏&&JMn「dflwnl,p^d f；r Jse Strand [jptiunii-isnOpen sap 1^ end extension gap 厂 ?ap M_dropafi pO ejcpej： t |1O. n wordFilter r?4,_.-1 . ■. . Enter icces sion or frl于 冒超quonos in FAST* ftnaatar down load frojn fils将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。
如果知道序列在数据库中的 GI 号也可以直接输 入 GI 号，这样就不用粘贴一大段的序列了最后在 3 处点击 Align 就可以查看引物在靶 DNA 中是否有多个 同源位点了可是使用 BLAST 还是有其不方便的地方因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行 比对如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大在下一篇中将介绍一个软件，可 以直接将靶DNA和引物输入对产物片段进行预测⑥ 引物末端引物3'端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始3'端不应超过3个连续的G或C,因这 样会使引物在G+C富集序列区错误引发3’端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR(AS-PCR) 反应中，引物3’端不能发生错配如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的 第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率⑦ 引物的二级结构引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引 物与模板的复性结合若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp两引物之间不应该存在互补 性，尤应避免3’端的互补重叠以防引物二聚体的形成。
一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基 的同源性或互补性⑧ 为了下一步操作而产生的不完全匹配5'端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性引物5’端修饰包括：加酶切 位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变 序列和引入一启动子序列等额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但 是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”很多时候PCR只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个 步骤为下一步的操作设计额外的碱基以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列a 添加限制性内切酶酶切位点添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点 的5'端还需要加2〜3个保护碱基但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：Sal I不需要 保护碱基，EcoRV需要1个，Not I需要2个，Hind III 3个其中，在原核表达设计引物时还有一些小技 巧，大家可以参考：《原核表达之实验前的分析》里面一些规则是所有表达都通用的有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切酶在PCR反应中的酶切反应率， 见附录。
不过这种方法虽然方便但并不推荐有时候，就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不 尽理想，同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂一旦出现问题，分析起来更麻烦b LIC添加尾巴LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一 种克隆方法用LIC法制备的pET载体有不互补的12-15碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互 补扩增目的插入片段的引物5'序列要与LIC载体互补T4 DNA聚合酶的3'—5'外切活性经短时间即可 在插入片段上形成单链粘端由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速 高效，而且为定向克隆c定向TA克隆添加尾巴在T载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的但是后来人们发现 TA克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有 四个突出的碱基GTGG因此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列,这样片段就可以“有方向” 了d In-Fusion克隆方法这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的。
此技术就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需 长时间的反应只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体 加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了这种方法特别适合大 批量的转化如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个PCR反应，比如在加入Not I的酶切位点 后整个引物的退火温度就会直线上升（它识别的是8个碱基，且全为GC），这样使另外一个引物的设计变 得十分困难，因为一对引物间退火温度相差不宜太远因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做到都符合在碰到这些情况的时候，我们只能秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一原则，要试一试才能知道能否行得通了。