实验一 糖的呈色反应和还原糖的检验一、实验目的1.学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法2.了解鉴定还原糖的方法及其原理二、实验原理糖经浓无机酸处理，脱水产生糠醛或糠醛衍生物戊糖形成糠醛，己糖则形成羟甲基糠醛这些糠醛和糖醛衍生物在浓无机酸作用下，能与酚类化合物缩合生成有色物质与一元酚如α一萘酚作用，形成三芳香环甲基有色物质与多元酚如间苯二酚作用，则形成氧杂蒽有色物质，反应式如下：通常使用的无机酸为硫酸如用盐酸，则必须加热常用的酚类为α一萘酚、甲基苯二酚、间苯二酚和间苯三酚等，有时也用芳香胺、胆酸、某些吲哚衍生物和一些嘧啶类化合物等有人认为，用浓硫酸作为脱水剂时，形成有颜色的产物与酚核的磺化有关，见如下反应式；（一）糖的呈色反应 1．Molish反应(α～萘酚反应) 本实验是鉴定糖类最常用的颜色反应糖在浓酸作用下形成的糠醛及其衍生物与α一萘酚作用，形成红紫色复合物在糖溶液与浓硫酸两液面间出现紫环，因此又称紫环反应自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等皆呈颜色近似的阳性反应因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。
2．蒽酮反应 糖经浓酸水解，脱水生成的糠醛及其衍生物与蒽酮(10一酮一9，10一二氢蒽)反应生成蓝一绿色复合物 3. Seliwanoff反应(间苯二酚反应) 该反应是鉴定酮糖的特殊反应在酸作用下，己酮糖脱水生成羟甲基糠醛后者与间苯二酚结合生成鲜红色的化合物，反应迅速，仅需20—30s在同样条件下，醛糖形成羟甲基糠醛较慢只有糖浓度较高时或需要较长时间的煮沸，才给出微弱的阳性反应蔗糖被盐酸水解生成的果糖也能给出阳性反应 4．Bial反应(甲基间苯二酚反应) 戊糖与浓盐酸加热形成糠醛，在有Fe3+存在下，它与甲基间苯二酚(地衣酚)缩合，形成深蓝色的沉淀物此沉淀物溶于正丁醇己糖也能发生反应，但产生灰绿色甚至棕色的沉淀物二）还原糖的鉴定含有自由醛基(一CHO)或酮基(>C==O)的单糖和二糖为还原糖在碱性溶液中，还原糖能将金属离子(铜、铋、汞、银等)还原，糖本身被氧化成酸类化合物，此性质常用于检验糖的还原性，并且常成为测定还原糖含量的各种方法的依据1．Fehling反应 费林试剂是含有硫酸铜与酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。
上述反应可用下列方程式表示：在碱性条件下，糖不仅发生烯醇化、异构化等作用也能发生糖分子的分解、氧化、还原或多聚作用等由这些作用所形成的复杂混合物具有强烈的还原作用，因此企图用简单的氧化还原作用来写出反应平衡式是不可能的为了防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehling试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2+形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应2. Benedict反应Benedict试剂是Fehling试剂的改良它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性比Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少，因而在实际应用中有更多的优点 3．Barfoed反应 该反应的特点是在酸性条件下进行还原作用在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异单糖在3min内就能还原Cu2+而还原二糖则需20min所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖当加热时间过长，非还原性二糖被水解也能呈现阳性反应，如蔗糖在10 min内水解而发生反应还原二糖浓度过高时，也会很快呈现阳性反应，若样品中含有少量氯化钠也会干扰此反应。
三、实验试剂和材料仪器1.测试糖液2％阿拉伯糖，葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，1％淀粉溶液和2种未知糖液2.试剂①Molish 氏试剂称取α－萘酚2克，溶于95％乙醇中并定容到100ml注意临用前，新鲜配制，贮于棕色瓶中②蒽酮(Anthrone)试剂 溶解0.2g蒽酮于100mL浓硫酸(A.R．，比重1.84，含量95%)中当日配制、使用 ③Fehling氏试剂 试剂A：将34.5g硫酸铜(CuSO4·5H20)溶于500mI蒸馏水中 试剂B：将125g氢氧化钠和137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，储于带橡皮塞瓶中临用时，将试剂A和B等量混合 ④Benedict氏试剂 溶解85g柠檬酸钠(Na3C6HO，·llH20)及50g无水碳酸钠于400mI水中；另溶8.5g硫酸铜于50mL将硫酸铜溶液缓缓倾人柠檬酸钠一碳酸钠溶液中，边加边搅，如有沉淀，可过滤．本试剂可长期使用如放置过久，出现沉淀．可取用其上清液 ⑤Bial氏试剂 溶解1.5g地衣酚(orcin01)于500mL，浓盐酸并加20—30滴10％三氯化铁溶液⑥Seliwanoff氏试剂 溶解50mg问苯二酚(resorcin01)于100rnl．，盐酸(盐酸：水=1:2V／V)中。
临用前配制盐酸浓度不宜超过12％，否则，它将导致糖形成糠醛或其衍生物⑦浓硫酸3.器材试管，试管架，煤气灯和沸水浴等四、实验方法（一）.糖的呈色反应1．Molish反应取8支已标号的试管，分别加入各种测试糖液lmL(约15滴)，再各加入Molish试剂2滴，摇匀逐一将试管倾斜，分别沿管壁慢慢加入浓硫酸l mL，然后，小心竖直试管，使糖液和硫酸清楚地分为两层，观察交界处颜色变化如几分钟内无呈色反应，可在热水浴中温热几分钟记录各管出现的颜色，说明原因，检定未知糖液2．蒽酮反应取8支标号的试管，分别加入lmL蒽酮溶液，再将测试糖液分别滴加到各试管内，混匀，观察颜色变化，鉴定未知糖液3．Seliwanoff反应取试管8支，编号，各加人Seliwanoff试剂ImL再依次分别加入测试糖液各4滴，混匀，同时放人沸水浴中，比较各管颜色变化及出现颜色的先后顺序，分析说明原因注意蔗糖的反应 4. bial反应将2滴测试糖液加到装有1ml Bial试剂的试管中,沸水浴中加热,观察颜色变化.如遇到未知糖呈色不明显,可以3倍体积水稀释,并加入1ml戊醇,摇动,醇液呈蓝色,即为阳性反应二）还原糖的鉴定1．Fehling反应 取8支试管，各加Fehling试剂A和B各lmL。
摇匀后，分别加人测试糖液各4滴，沸水浴煮2—3min，取出冷却，观察沉淀和颜色的变化2. Benedict反应 于8支试管中先各加入Benedict试剂2ml,再分别加入测试糖各4滴,沸水浴中煮2-3min,冷却后,观察颜色变化.3.barfoed反应分别加入测试糖液2-3滴到含有1ml Barfoed试剂的试管中,煮沸约3min,放置20min以上,比较各管颜色变化及红色出现的先后顺序.五、注意事项1. Molisch反应非常灵敏，0．001％葡萄糖和0．0001％蔗糖即能呈现阳性反应因此，不可使碎纸屑或滤纸毛混入样品中过浓的果糖溶液，由于硫酸对它的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色需稀释糖溶液后重做2.果糖在Seliwanoff试剂中反应十分迅速，呈鲜红色，而葡萄糖所需时间长，且只能产生黄色至淡红色戊糖亦与Seliwanoff试剂反应，戊糖经酸脱水生成糠醛，与间苯二酚缩合生成绿色到蓝色产物3.酮基本身并没有还原性，只有在变为烯醇式后，才显示还原作用4.糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小，Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度反应速度快时，生成的Cu2O颗粒较小，呈黄绿色；反应慢时，生成的Cu2O颗粒较大，呈红色。
有保护胶体存在时，常生成黄色沉淀实际生成的沉淀含有大小不同的Cu2O颗粒，因而每次观察到颜色可能略有不同溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计，而不能依据沉淀的颜色来区别5.Barfoed反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部，溶液仍为深蓝色应注意观察试管底部红色的出现，它与一般还原性实验不相同，观察不到反应液由蓝色变绿变黄或变红的过程六、思考题 1．列表总结和比较本实验7种颜色反应的原理及其应用 2．应用Molish反应和Seliwanoff反应分析未知样品时，应注意些什么问题? 3．举例说明哪些糖属于还原糖 4．运用本实验的方法，设计一个鉴定未知糖的方案5．牛乳中含有5％双糖如何证明牛乳中有双糖存在?这种双糖是什么糖?请选用一些颜色反应来加以鉴定 实验二 3，5－二硝基水杨酸比色定糖法一、目的和要求1.掌握 3，5-二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法2.掌握分光光度计的使用方法二、721分光光度计的使用分光分析原理有色溶液对光线有选择性的吸收作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱有些无色溶液，虽对可见光无吸收作用，但所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。
吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质分光分析法常用于测定溶液中存在的光吸收物质的浓度，其理论依据是Lambert- Beer定律一）Lambert定律 当一束单色光通过一均匀溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱，若溶液的浓度(C)不变则液层的厚度(L)愈大，光线强度的减弱也愈显著若C不变， OD ∝ L （二） Beer定律 当一束单色光通过一均匀溶液时，若液层的厚度不变，则溶液浓度愈高，光线强度的减弱也愈显著若L不变： OD ∝ C（三）Lambert-Beer 定律及其应用1．Lambert-Beer 定律：I0IT= =10—KCL当一束单色光通过一均匀溶液时，该溶液对光吸收的程度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比其关系式如下：两边取对数得：lgT=–KCL I0ICL图6 一束单色光通过溶液时的情况示意图式中T为透光度，I0为入射光强度，I为透过光的强度，C为溶液的浓度，–lgII0L为液层的厚度K为常数，称为消光系数，其数值与物质种类、光线波长和溶液温度有关 OD（或A）=–=–lgT=KCLlgII0若将 用光密度（OD）表示该溶液对光线吸收的情况（有的也用吸光度A表示），则它们之间的关系如下： 2．待测溶液浓度的计算： 根据Lambert-Beer定律 标准溶液：ODs=KsCsLs待测溶液：ODu=KuCuLu当两种溶液的液层厚度相等（Lu = Ls）、温度相同、且波长也相同（相同物质的两种不同浓度）时，则Ku=Ks。
ODsODuCsCu=两式相比得：Cu= ×CsODuODs即：721E型分光光度计的操作 这是一种采用光电管为受光器的较高级的可见光分光光度计其波长范围为360-800nm，在410-710nm之间的灵敏度较好使用方法如下： 1. 转动波长选择钮，选用所需的波长2. 接通电源（指示灯亮），打开电源开关3. 将机器预热20分钟4. 按动“Mode”键，模式转换到“T”模式5. 拉动比色皿座的。