热线：021－5446 0832 8009881995 E-mail:master@ 网址： 1荧光定量 PCR 一步法 RT-PCR 使用说明书荧光定量 PCR 一步法 RT-PCR 使用说明书 本试剂盒适用于各种动、植物、病毒 RNA 的荧光定量 PCR 检测，反转录 PCR 反应体系为30µl，用户在使用此试剂盒之前请详细阅读此说明书 本试剂盒主要有两个部分组成：RT-PCR MIX 和 2×反应缓冲液RT-PCR MIX 由反转录酶和 Taq DNA 聚合酶组成的混合酶，既可 cDNA 合成又可 PCR 扩增2×反应缓冲液对其主要成分 Mg2+、dNTPs 及稳定剂都已经优化，直接用于荧光定量 PCR 的检测，用户只需加入引物探针和一定的模板即可，适用各种荧光定量 PCR 仪如：lightcycler、ABI7000、icycler 等 （本试剂盒不适合做 sybr green 染料法） 编号：编号：ZK00101 规格：规格：10 次 试剂盒组成：试剂盒组成： 名 称 浓 度 体 积 2×反应缓冲液 300µl RT-PCR MIX 20µl 实验操作实验操作: 1． 取 103-106拷贝的特异目的模板或 1pg-1µg的总RNA或 1-10ng纯化的mRNA于一支 0.2 或0.5ml离心管中， 65-70℃保温 5-10 分钟， 离心数秒， 放置冰浴中。
此步骤是为了变性RNA，建议保留） 2． 反应体系的配制： 组分组分 体积体积 终浓度终浓度 2× 反应缓冲液 15µl 1× 下游引物*(25pmol/ul) 1ul 0.5-1µM 上游引物*(25pmol/ul) 1ul 0.5-1µM 荧光探针*(25pmol/ul) 0.3ull 0.2-0.5uM RT-PCR MIX 2µl RNA样品或对照** Yµl DEPC-ddH2O（加至终体积为30µl）Xµl 终体积 30µl 按照指定的体积将 DEPC-ddH2O、2x 反应缓冲液、RT-PCR MIX、特异上下游引物探针加入到置于冰上的 0.2ml 薄壁反应管中，配制成反应混合物，将反应管轻柔震荡 10 秒以使该热线：021－5446 0832 8009881995 E-mail:master@ 网址： 2混合物混匀每次加样均应使用单独的加样器枪头，小心勿使样品之间相互污染 * 计算引物为 50pmol 时所对应的质量（纳克）的通用公式为：50pmol=16.3ng×b；b 为引物碱基数目 对于阳性对照反应，上、下游对照引物均使用 3.3µl（50pmol） 。
**103-106拷贝的特异目的模板或 1pg-1µg的总RNA使用 2µl带有载体的阳性对照RNA（2.5 attomole或 1×106个拷贝） 3．如果热循环仪无热盖功能， 则须加入 1 或 2 滴 （20-40µl） 无核酸酶的矿物油覆盖反应体系，以防止反应物浓缩和蒸发 1)FTC2000、PE5700、7700、7300、icycler、Rotogene 等荧光仪的程序设置 1)FTC2000、PE5700、7700、7300、icycler、Rotogene 等荧光仪的程序设置 48℃反应 30 分钟，然后 94℃保温 5 分钟，再按 94℃20 秒→60℃30 秒循环 40 次 2)lightcycler 荧光仪的程序设置 2)lightcycler 荧光仪的程序设置 反应管置于 LightCycler 自动荧光 PCR 仪上，48℃反应 20 分钟，94℃2 分钟，再按 94℃5 秒→60℃20 秒循环 40 次，每个循环的升降温速率为 20℃/S，每个循环在 60℃20 秒处进行荧光检测设置 试剂盒说明： 试剂盒说明： 1. 储存：-20℃冻存，至少稳定 6 个月。
2. 用户所使用离心管、吸头均需经过 DEPC 处理并高压灭菌 3. 总 RNA 若有轻微降解，目的基因同样能扩增出来 4. 如果不是用 taqman 探针，如 beacon 探针，可以使用三步法的扩增程序 5. 第一步的反转录温度可以根据下游引物的退火温度在 42 度到 48 度之间调整 6. 用户可以根据引物探针的 Tm 值，适当地调整退火温度 7. Only for Research! 上海闪晶分子生物科技有限公司 上海闪晶分子生物科技有限公司 地址：上海市闵行区北桥镇吴河路3 2 8 号A 栋2 楼 邮编：201109联系：市场部 ：54460832 800-988-1995 E-mail:master@ 网址： 。