蛋白质的定量测定

实验名称：蛋白质的定量测定…考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-燃料结合的原理考马斯亮蓝G-250染料， 在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰 转至595nm，且其光吸收值与蛋白质含量（10〜100〃g/ml蛋白质浓度）成正比，因此可用 于蛋白质的定量测定实验准备】一、 材料（1）血清二、 试剂（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷 酸，用蒸馏水稀释至1000ml2）标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根基其纯 度用0.15mol/L NaCl配置成1.0mg/ml蛋白溶液3）0.9% NaCl溶液三、 器材（1） 试管和试管架（2） 722型分光光度计（3） 吸量管（4） 移液枪【实验步骤】一、制作标准曲线取6支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂管号01234标准蛋白溶液/ml00.10.20.30.40.9%NaCl 溶液/ml0.50.40.30.20.1考马斯亮蓝试剂/ml2.52.52.52.52.5各管混匀后，静置3min，以0号管为空白管调零，在595nm波长下分别测定各管溶液的吸 光度值（a595值）。

以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线二、血清蛋白质浓度测定测定方法同上1mL稀释血清加2.5mL考马斯亮蓝试剂，血清用0.9%NaCl稀释200倍，使其测定值在标准曲线的直线范围内用上述0号管调零，测出血清的A595值实验结果】（1） 测定数据如下表蛋白质溶液浓度 mg/ml00.20.40.60.8吸光度值00.0610.1310.1950.24以吸光度a595值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标绘制标准曲线蛋白质浓度/mgml 11—mc髯度光吸595nm波长下吸光度随蛋白质浓度的变化图♦ 595nm波长下吸光度 随蛋白质浓度的变化 图——线性(595nm波长下吸 光度随蛋白质浓度的 变化图)(2)根据所测血清的值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，乘以稀释倍数，从而 计算出血清的蛋白质浓度(mg/ml)0.26 mg/ml【实验讨论】① 必须在试剂加入后的5〜20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的② 测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将比色杯 洗干净③ 不要将标准蛋白质和待测蛋白质搞混，以免造成实验结果的改变。

④ 考马斯亮蓝(CBB)显色法测定蛋白质含量的主要缺点之一是线性关系差.通过 研究显色液组分对线性关系的影响，发现显色液H+浓度是影响线性关系的主要因素 【1】⑤ 考马斯亮法可排除添加非蛋白含氮物对奶粉真蛋白含量测定的影响，可以快速、准确 的测定奶粉真蛋白含量⑵参考文献】1. 郭敏亮；姜涌明，生物化学与生物物理进展，1996 (06)2. 董娜；贾艳菊；张晓；齐志广，食品科技，2011 (11)。