单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,实时定量,PCRQuantitative Real-Time PCR,梁沛,中国农业大学昆虫学系,1实时定量PCRQuantitative Real-Tim,2,主要内容,基本原理,几个概念,绝对定量,相对定量,常见问题,2主要内容基本原理,3,一、基本原理,3一、基本原理,4,发展简史,1993,年，日本,Higuchi,等人首次采用动态,PCR,的方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量,PCR,技术的概念荧光染料：,EB,（溴乙锭）,PCR,仪：改良的热循环仪,激发光：,UV,射线,检测器：,CCD,相机,缺点：仪器耗费巨大；非特异产物导致定量不准确,4发展简史1993年，日本Higuchi 等人首次采用动态P,5,发展简史,1995,年美国,PE,公司成功开发,TaqMan,技术,1996,年推出了首台荧光定量,PCR,检测系统,优点：,操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等,5发展简史1995年美国PE公司成功开发TaqMan技术,6,实时定量,PCR,的概念,实时定量,PCR,技术（,real-time quantitative PCR,）,是指在,PCR,反应体系中加入,荧光染料,，实时监测整个,PCR,过程中荧光信号的累积强度，并利用特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。
6实时定量PCR的概念实时定量PCR技术（real-time,RT-PCR,：,R,everse-,t,ranscription PCR,qRT-PCR:,q,uantitative,R,eal-,t,ime PCR,7,RT-PCR：Reverse-transcription P,8,ABI 7300,荧光定量,PCR,仪,ABI,：,Applied,Biosystems,Inc.,8ABI 7300 荧光定量PCR仪ABI：Applied,9,9,检测通道,2004,年推出的,7300,和,7500,均为第三代产品，,2001,推出的,7900,为第二代产品7300,：,4,通道,7500,：,5,通道,均需加,Rox,染料进行校正,10,检测通道2004年推出的7300和7500均为第三代产品，2,11,两种荧光标记法,1.,染料染色,-,SYBR Green I,-EB,2.,探针标记,-Taqman,-Taqman MGB,-,分子信标,11两种荧光标记法1.染料染色,12,SYBR Green I,的最大吸收波长约为,497nm,，发射波长最大约为,520nm,1.,荧光染料法,12SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm,13,化学原理,13化学原理,14,染料法的优缺点,优点,：,实验设计简单，仅需要设计一对上下游引物，不需要设计探针，通用性好；,成本低；,可通过,溶解曲线,分析检验扩增产物的特异性。
低通量实验一般优先考虑使用,SYBR Green I,染料法14染料法的优缺点优点：,15,染料法的优缺点,缺点,SYBR Green I,方法对,PCR,扩增特异性要求较高,SYBR Green I,可与所有的双链,DNA,相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性,SYBR Green I,不能区分不同扩增片段发出的荧光而导致它不能用于多重反应,15染料法的优缺点缺点,16,2.,荧光探针法,(Taqman),162.荧光探针法(Taqman),17,Taqman Probe,Quencher,Reporter,17Taqman ProbeQuencherReporter,18,Tagman probe,的工作原理,18Tagman probe 的工作原理,19,探针与,PCR,产物的数量关系,每产生一个新的,DNA,片段，就切断一条探针,每切断一条探针，就产生一个单位的荧光信号,信号强度与,DNA,的,copy,数成正比,19探针与PCR产物的数量关系每产生一个新的DNA片段，就切,20,探针法的优缺点,优点：,Tagman,探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特异产物的干扰影响定量的准确性,可用于多重反应，即可同时检测多个目的基因。
缺点：,但探针设计成本较高，有时探针设计困难20探针法的优缺点优点：,21,二、几个概念,21二、几个概念,22,1.,扩增曲线,描述,PCR,动态进程的曲线称为扩增曲线PCR,的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈,S,型曲线,Cycles,Fluoresces,221.扩增曲线描述PCR动态进程的曲线称为扩增曲线Cyc,23,1.,扩增曲线,扩增曲线分三个阶段：,荧光背景信号阶段,(,基线期,),：,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化荧光信号指数扩增阶段（对数期）,，,PCR,产物量的对数值与起始模板量之间存性关系，可选择该阶段进行定量分析在平台期：,扩增产物已不再呈指数级的增加PCR,的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的,PCR,产物量不能计算出起始,DNA,拷贝数231.扩增曲线扩增曲线分三个阶段：,24,2.,荧光阈值,一般把荧光,PCR,的前,15,个循环信号作为荧光本底信号（,baseline,，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖是人为设定的一个值，可设在指数扩增阶段任意位置上。
缺省设置是,3,15,个循环的荧光信号的标准偏差的,10,倍（自动）242.荧光阈值一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本,2.荧光阈值,25,2.荧光阈值25,26,2.,荧光阈值,手动设置，原则：大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是超过域值的荧光信号262.荧光阈值手动设置，原则：大于样本的荧光背景值和阴性对,27,3.,C,t,值,Cycle threshold,，就是当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环次数线性图谱,半对数图谱,C,t,值,C,t,值,273.Ct值Cycle threshold，就是当扩增产,28,C,t,值的重现性,28Ct值的重现性,29,3.,C,t,值,Ct,值与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，达到阈值所需的循环数就越少，,Ct,值也就越小，反之亦然正常的,Ct,值范围在,18-30,之间，过大和过小都将影响实验数据的精度293.Ct值Ct值与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝,30,30,31,Ct,值定量的数学原理,31Ct值定量的数学原理,32,Ct,值定量的数学原理,32Ct值定量的数学原理,33,Ct,值定量的数学原理,33Ct值定量的数学原理,34,Ct,值定量的数学原理,Threshold,10,4,10,3,10,2,34Ct值定量的数学原理Threshold104103102,35,靶标基因的定量,35靶标基因的定量,36,靶标基因的定量,5000,10000,1,2,需要制备标准品,需制作绝对标准曲线,无需标准品，,需制作相对标准曲线,36靶标基因的定量50001000012需要制备标准品无需标,37,靶标基因的定量,CYP6B6,Actin,Northern blot,半定量,PCR,37靶标基因的定量CYP6B6ActinNorthern b,38,三、绝对定量,38三、绝对定量,39,三、绝对定量,39三、绝对定量,40,三、绝对定量,标准品的一些标准：,必需用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同,标准品必需是经过准确定量的（例如，用分光光度计定量）,标准品必需是标准化的（例如，同一化的细胞数）,在每组实验时，标准品和待测样品必需用相同的阈值来确定,Ct,值,40三、绝对定量标准品的一些标准：,41,三、绝对定量,标准品的制备方法：,1.,化学合成目的基因，,优点,是纯度高、定量准确,缺点,是受化学合成工艺限制，只能合成,120bp,以下的长度；,2.,回收纯化,PCR,产物后克隆到载体上，然后抽提质粒，经过测量浓度和拷贝数的换算，可准确定量,优点,是稳定、准确。
41三、绝对定量标准品的制备方法：,42,三、绝对定量,标准品倍比梯度稀释方法：,10v,原液,(,标准品,i,)+90v,稀释缓冲液，得标准品,ii,10v,标准品,ii,+90v,稀释缓冲液，得标准品,iii,10v,标准品,iii,+90v,稀释缓冲液，得标准品,iv,10v,标准品,iv,+90v,稀释缓冲液，得标准品,v,Why?,42三、绝对定量标准品倍比梯度稀释方法：Why?,43,三、绝对定量,拷贝数的计算,(,以,dsDNA,为例）,待测样本浓度,（,ng/ul,）,OD,260,50,稀释倍数,样本分子量,=,碱基数,660,dalton/bp,待测样本拷贝数,（,copies/ul,）,=,待测样本质量,/,样本分子量,610,14,43三、绝对定量拷贝数的计算(以dsDNA为例）,44,三、绝对定量,拷贝数的计算举例：,3000,碱基质粒，浓度,100 ng/ul,MW=3000 bp x 660 dalton/bp=1.98 x 10,6,daltons,copy,数,-,610,14,3x 10,10,copies/ul,100ng,1.98 x 10,6,44三、绝对定量拷贝数的计算举例：copy数-,45,绝对定量举例,Copies/ul,Ct 1,Ct 2,Meant Ct,STD,510,3,28.18,28.64,28.41,0.16,510,4,25.25,25.14,25.19,0.04,510,5,22.11,22.46,22.28,0.12,510,6,18.63,18.92,18.77,0.10,Blank,棉铃虫,Cyp6B2,基因拷贝数检测,45绝对定量举例Copies/ulCt 1Ct 2Meant,46,绝对定量举例,扩增效率（,E,）计算,E=10,-1/,斜率,=10,-1/-3.18,=2.06,E%=(2.06-1)100%,=106%,46绝对定量举例扩增效率（E）计算,47,绝对定量举例,如未知样本,Ct,为,20.5,，将,Ct,值带入线性方程：,20.5=-3.183 X+40.211,X=,（,20.5-40.211,）,/-3.183,=6.19,未知样本拷贝数,=10,6.19,=1548816 copies/ul,47绝对定量举例如未知样本Ct为20.5，将Ct值带入线性方,48,四、相对定量,无需知道目的基因的绝对拷贝数,需要注意的问题：,1.,模板均一性问题,：起始的细胞数、细胞的状态、均一性等,2.,RNA,制备,：,RNA,纯化得率、均一性等,3.,反转录,：反转录的效率等,48四、相对定量无需知道目的基因的绝对拷贝数,49,内标,/,内参照,因,RNA,纯化后得率不同、,RNA,反转录为,cDNA,的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度可能不同。
因此，在进行基因表达研究中都会用看家基因（,house-keeping gene,）对数据进行标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异常用的看家基因有：,GAPDH,、,Beta-actin,、,18S rRNA,等,49内标/内参照因RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDN,50,相对定量的方法,双标准曲线法,Ct,法,50相对定量的方法双标准曲线法,51,双标准曲线法,优点：,分析简单，实验优化简单缺点：,对,每一个基因,，,每一轮实验,都必需做标准曲线；必需有固定的标准品做标准曲线；这些标准品并不代表样品扩增的真实状。