酵母过氧化氢酶（CAT）的测定方法一、人丁提取1. 准备材料、仪器及试剂材料：酵母：5g仪器：天平、电子天平研钵（1个），石英砂，玻璃匀浆器冰箱（1台）玻璃棒（1个）高速离心机离心管容量瓶（1000ml、100ml）量筒SephadexG-75柱试剂：Na2HPO4、NaH2PO4 （0.1M磷酸缓冲溶液（PBS）: PH=7.0 ， 20ml）、（NH4）2SO41.1 0.1M PBS 配制母液的配制配制时，常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)，根据需要可配制不同浓度PBS0.2M Na2HPO4:称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 水；0.2M NaH2PO4:称取 31.2g NaH2PO4-2H2O,溶于 1000ml 水(3) 0.2mol/L pH5.7〜8. 0的PBS的配制如下：取n ml 0.2mol/L的 NaH2PO4和mml 0.2mol/L的 Na2HPO4 - 12H2O,充分混合即为0.2mol/L的PBS.若pH偏高或偏低，可通过改变二者的比例来加以调整，室温保存即可。
pH0.2M NaH2PO4 (ml) (n)0.2M Na2HPO4 (ml) (m)5.793.56.55.89285.990106.087.712.36.185156.281.518.56.377.522.56.473.526.56.568.531.56.662.537.56.756.543.56.851496.945557.038627.133677.228727.323777.419817.516847.613877.710.589.57.88.591.57.97938.05.394.70.1MPBS 配制0.1MPBS(PH=7.0):取 500ml 0.2M PBS (38ml 0.2M NaH2PO4(ml )+62 ml 0.2M Na2HPO4(ml) ｝，加水稀释至1000ml即可2. CAT提取称取干酵母5g—研磨一加20 mL 0.1 mol/L (pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS) — 4°C下 放置30 min—玻璃匀浆器研磨20 min(使酵母细胞充分破壁，释放出酶)一 10000 r/min(4C )离心15 min—取上清液作为粗酶液(用于测定CAT活性，并用于进一步纯 化)3. CAT的提纯以上的粗酶上清液中加人固体(NH4)2SO4，使其饱和度达到70%—4°C静置15 min—4°C用14 000 r/min离心15 min—取上清液一测定CAT活性一上清液中加人固体 (NH4)2SO4，使其饱和度达到80% 一 4C静置 15 min 一 14 000 r/min离心15 min— 取沉淀一沉淀用1 mL 0.1 mol/L的PBS(pH7.0)溶解一测定CAT活性。
将此液上SephadexG-75柱一于4C下层析一用0.1 mol/L的PBS( pH7.0)洗脱一 用自动部分收集器收集洗脱液，速度控制在每管3.5 mL/5 min—测定每管的CAT活力 及蛋白含量一直收集到没有酶活性为止4. 酶活力及蛋白浓度测定CAT活力测定用紫外分光光度法进行在30C下，取2.9 mL含0.1%H202的PBS(0.1 mol/L pH7.0)放人752型分光光度计，加人稀释酶液0.1 mL，立即在240 nm，波 长处测定该混合体系在3 min内光吸收值的变化底物浓度控制在A240nm=0.5左 右(参考文献：林少琴，兰瑞芳，余萍贻贝过氧化氢酶的纯化及部分性质［期刊 论文-食品科学2000 (11))蛋白质浓度参照Brad-ford (参考文献：Bradford MM A rapid and sensitive method for the quantitafion of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding外 文期刊］1976 (1-2))的方法测定，以牛血清白蛋白作标准。
每分钟每毫克蛋白 质在240 nm波长下使光密度值下降0.001定义为一个酶活力单位(Umg-1 protein min-1 )各测定均重复5次5. CAT光谱的测定将CAT在H66025超声发生器上用一定参数的超声波处理后，立即用960 MC荧光光度计测 定其荧光发射光谱并用原纯酶作对照用UV-2401 PC型光谱仪分别测定CAT纯酶和经超 声波处理过的CAT纯酶的紫外吸收光谱并在UV-2401 PC光谱仪测定用超声处理后CAT 的紫外差示光谱6. CAT的催化动力学分析以不同浓度的底物测定经超声处理过的CAT和未经超声处理过的CAT的反应速度，用 Lineweaverburk作图法作出双倒数曲线图，求出米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)。