学号编号研究类型基础研究分类号Q51毕业论文（设计）Bachelor’s Thesis论文题目精氨酸激酶（AK）的提取与纯化作者姓名指导教师所在院系生物系专业名称生物科学完成时间2007年6月6日7 主要符号对照表AK 精氨酸激酶E.coli 大肠杆菌IPTG 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷Kanamycin 卡拉霉素CMC CM-CelluloseS-100 SephacrylTM-1002-mercaptoethanol 巯基乙醇Glycine 甘氨酸PMSF 苯甲基磺酰氟 EDTA 乙二胺四乙酸NaN3 迭氮钠Arg 精氨酸ADP 二磷酸腺苷ATP 三磷酸腺苷h 小时min 分钟目 录1引言 11.1精氨酸激酶（AK） 11.2蛋白质的分离与纯化 22实验试剂以及实验仪器： 52.1实验材料 52.2主要实验试剂与仪器 83实验方法 93.1活化菌种 93.2扩大培养 93.3 IPTG诱导AK基因的表达 93.4 蛋白质提取 93.5蛋白质的检测 103.6蛋白质的纯化 104结果与分析 124.1 AK诱导表达电泳图 124.2 蛋白质经CMC离子交换的层析谱图和电泳图 134.3蛋白质经分子筛S-100交换的层析谱图和电泳图 144.4蛋白质经Q－sepharose阳离子交换的层析谱图和电泳图 164.5 AK经各步纯化后的SDS-PAGE电泳图谱 175讨论 18参考文献： 20精氨酸激酶（AK）的提取与纯化 摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
重组有AK基因的E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml的卡纳霉素的LB培养基中培养当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液通过CM-Cellulose阳离子交换层析，SephacrylTM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电泳纯的精氨酸激酶关键词：精氨酸激酶 提取与纯化Extraction and Purification of Arginine KinaseAbstract： Arginine kinase（ATP：L-arginine phosphotransferase EC 2.7.3.3），plays an important role in cellular energy metabolism in invertebrate. E. coli Rosetta which contains recombinant AK gene was grown in LB medium containing kanamycin (Final concentration: 25 μg/mL). When absorbance at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropyl β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the incubation was continued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, then the crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified by following three methods in turn: CM-Cellulose positive ion exchange chromatography, SephacrylTM-100gel filtrate chromatography, and Q-Sepharose anion exchange chromatography. A purified AK was found to be homogenous by SDS poly -acrylaminde gel electrophoresis. Key words: arginine kinase extraction and purification 精氨酸激酶（AK）的提取与纯化1引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶[1]（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。
AK在体内催化如下反应：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD某些物种的精氨酸激酶的晶体结构已经被解析出来，AK是由一个小的α螺旋组成的N端结构域和一个大的C端结构域组成的，C端结构域与Glu合成酶的C端结构域相似，8股串起来的反平行β折叠被7个α螺旋所包绕[2]过渡态类似物的结合部位不在两个结构域之间，而是在C端结构域的内部[3]。
如下图所示[4]：图1. 结合有过渡态类似物的AK的晶体结构我们已经克隆有精氨酸激酶基因的菌株，宿主菌含表达质粒pET28a, pET28a含：强启动子序列，两个lac操纵序列；精氨酸激酶基因，核糖体结合位点，多克隆位点，复制起点在工程菌株中，导入抗Kana青霉素的pET28a质粒，菌株中原有质粒产生阻遏蛋白，这种阻遏蛋白与pET28a的LacO操纵基因结合，阻止外源基因的表达当加入IPTG诱导时，IPTG与阻遏蛋白结合，解除了阻遏蛋白与pET28a操纵基因结合的抑制作用，使pET28a上面的外源基因能够顺利表达[5]IPTG是一种乳糖类似物，我们的主要目的是诱导表达并纯化精氨酸激酶，为后续研究其在蛋白质折叠和分子伴侣中的功能做准备1.2蛋白质的分离与纯化1.2.1细胞的破碎1)高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等2)玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织3)超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。
对超声波敏感和核酸应慎用4)反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎5)化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好1.2.2蛋白质（包括酶）的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶1.2.3蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：1.2.3.1根据蛋白质溶解度不同的分离方法1)蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
2)等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用3)低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行1.2.3.2根据蛋白质分子大小的差别的分离方法1)透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开 超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质2)凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel）1.2.3.3根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开1)电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2)离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素，CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素，DEAE），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来1.2.3.4根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法 亲和层析法（af 。