第五章 层析分离技术 Inordertopurifyproteins,peptidesandnucleicacidsweneedpowerfultechniques.1l概念：层析技术(又称：色谱技术)是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的层析技术的原理2n层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”n1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础3一、层析的原理n层析技术是一组相关分离方法的总称，当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随流动相向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配，从而达到将各组份分离的目的。
第一节 层析概述4 5二、层析的分类n 按固定相基质的形式： 柱层析、纸层析和薄层层析 6 n根据流动相的形式： 液相层析、气相层析 7层析分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的层析方法：按机理分为：吸附层析分配层析离子交换层析凝胶层析亲和层析n根据分离作用机理的分类GelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinityReversedPhase8 凝胶过滤原理吸附层析疏水层析分配层析亲和层析离子交换9三、层析基本操作过程装置选择上样和洗脱结果检测 上样均一性 洗脱装置目的不同 检测方法不同活性检测基质均匀性柱层析的L/d比值101、柱层析的L/d比值112、洗脱装置v 不改变溶剂体系 依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小改善：蠕动泵或恒流泵维持流速恒定的简易装置12 n改变溶剂系统 分级洗脱 在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密同一个洗脱级分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。
递减递增pH阴离子交换树 脂阳离子交换树 脂离子强度疏水层析离子交换层 析13 梯度洗脱 一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质线性梯度洗脱装置性能未知样品的蛋白质分离： 改变缓慢的梯度洗脱若为单峰：分级洗脱143、结果检测n活性检测l 比活没有提高 目的蛋白与杂蛋白并没有分开l 比活有所提高，但总活性回收很低 目的蛋白有损失或有失活现象l测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性15n结果保存l薄层层析&纸层析 照相保存or 扫描仪转为图形or 积分仪变成数据l柱层析 检测器、记录仪和积分仪处理164、层析装置的仪器化nHPLCv与微机、质谱等连用17四、层析前蛋白质处理 主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低181、盐析法 盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。
192、等电点沉淀 在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中203、有机溶剂沉淀 降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀； 有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀21五、层析系统的基本概念及要求qResolutionqEfficiencyqSelectivityqSymmetry22层析分离的基本概念u 分配系数可由Langmuir方程得出Kd-分配系数q、c-溶质在固相和液相中的浓度23层析分离的基本概念u滞留时间（tR）和滞留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一24层析分离的基本概念u 洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异25层析分离的基本概念Resolution factor RsRs=4Rs=0.6Rs=1Resolution=PeakseparationPeakwidthatheightu分辨率（Resolution,Rs）26层析分离的基本概念Resolution: depends on efficiency and selectivityHighefficiencyLowefficiencyHighselectivityLowerselectivityuuEfficiencyEfficiency:qIsameasureofpeakwidthqHighefficiencymeanssharppeaksqHighefficiencymeansagoodpackedcolumnqHighefficiencycancompensateforlowselectivityuuSelectivitySelectivity:qIsameasureofpeakseparationqHighselectivitygivesbaselineseparationsqIfselectivityishigh,lowefficiencycanbetolerated(iflargepeakvolumeisacceptable).27层析分离的基本概念u色谱柱的理论塔板数N与高度HN-N-理论塔板数理论塔板数 tRtR-保留时间保留时间W1/2-W1/2-半峰宽半峰宽理论塔板高度：理论塔板高度：L-L-柱长柱长VrWh = Peak width at half peak heightAU28028层析分离的基本概念Efficiency depends on: qParticle size of matrixqParticle size distribution of matrixqPacking quality of the columnqSample (volume and viscosity)qFlow rate29Resolution: the power to separate peaks200400ml0MaximumnumberofpeaksinRPC15001020mlMaximumnumberofpeaksingelfiltrationca15Remember: we are not purifying peaks, but proteins & peptides !层析分离的基本概念30一、原理n 根据物料中各组分对固定相(吸附剂) 的吸附程度不同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异来实现。
经反复的吸附解吸再吸附再解吸的过程，达到分离目的n 无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华力和偶极力相互作用第二节 吸附层析31机理:样品组分对固定相表 面吸附力不同进行组份分离吸附剂: Al2O3, SiO2(硅胶), 聚酰胺等吸附剂和洗脱剂的选择:物质极性 吸附活性 洗脱剂极性 强 小 强 弱 大 弱32常见的吸附类型及其主要特点常见的吸附类型及其主要特点n物理吸附： 吸附作用力为分子间引力、无选择性、无需高活化能、吸附层可以是单层，也可以是多层、吸附和解吸附速度通常较快n化学吸附：吸附作用力为化学键合力，需要高活化能、只能以单分子层吸附，选择性强、吸附和解吸附速度较慢33常用吸附剂:u氧化铝u硅胶u活性炭u纤维素u聚酰胺u硅藻土装柱加入样品层析后常用洗脱剂极性次序:石油醚环己烷CCl4甲苯CH2Cl2CHCl3乙醚醋酸乙酯正丙醇乙醇甲醇90%；n机械强度：90%；n含水量：0.30.7g/g 树脂；n交换容量：重量交换容量、体积交换容量、工作交换容量或称表观交换容量（在某一条件下）；n稳定性：化学稳定性、热稳定性；n膨胀度：交联度、活性基团的性质与数量、活性离子的性质、介质的性质和浓度、骨架结构；n湿真密度：单位体积湿树脂的重量；n孔度、孔径、比表面积94影响离子交换树脂选择性的因素n水合离子半径：半径越小，亲和力越大；n离子化合价：高价离子易于被吸附；n溶液pH：影响交换基团和交换离子的解离程度，但不影响交换容量；n离子强度：越低越好；n有机溶剂：不利于吸附；n交联度、膨胀度、分子筛：交联度大，膨胀度小，筛分能力增大；交联度小，膨胀度大，吸附量减少； n树脂与粒子间的辅助力：除静电力以外，还有氢键和范德华力等辅助力；95l离子交换纤维素 树脂骨架为纤维素分类：根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两类特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高。
常用的离子交换纤维素有： 甲基磺酸纤维素、羧甲基纤维素、二乙基氨基乙基纤维素 96DEAE anion exchanger97CMC Cation Exchanger98 离子交换纤维素交换剂名称（纤维 素）作 用 基 团特 点阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H氨乙基AE+-O-C2H4-NH2胍乙基强碱性、极高pH仍有效阳离子交换剂羧甲基CM-O-CH2-COO最常用在pH4以上磷酸P-O-PO2 用于低pH磺甲基SM-O-CH2-SO3磺乙基磺丙基SE-O-C2H4-SO3SP-O-C3H6-SO3强酸性用于极低pH99 n常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素）CM-纤维素（羧甲基纤维素）l开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多l亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活 l回收率高 优点：100l葡聚糖凝胶离子交换树脂骨架为葡聚糖凝胶，如Sephadex，根据功能基团的不同，亦可分为阳离子交换和阴离子交换树脂n命名方法：交换活性基团+骨架+原骨架编号n特点：除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高了分离的效率n常用的葡聚糖凝胶离子交换树脂：CM-sephadex C-25、DEAE-sephadex A-25等101 常用离子交换葡聚糖凝胶类型性能离子基因反离子总交换容量（毫克当量/g）DEAE-sephadexA-25弱碱性、阴离子交换剂DEAE+Cl3.50.5DEAE-sephadexA-50QAE-sephadex-25弱碱性、阴离子交换剂QAE+Cl3.00.4QAE-sephadexA-50CM-A-sephadex25弱碱性、阳离子交换剂CMNa+4.50.5CM-sephadexA-50SP-sephadexA-25强碱性、阳离子交换剂SPNa+2.30.3SP-sephadexA-50102 n优点：u不会引起被分离物质的变性或失活u非特异性吸附少u交换容量大 离子交换葡聚糖的选用： 一般根据蛋白质的分子量而定u中等分子量（30000-200000）一般选A50和C50u低分子量（30000）和高分子量（200000） 均宜选用A25和C25。